全血胆碱酯酶活性的分光光度测定方法 硫代乙酰胆碱-联硫代双硝基苯甲酸法 WST 67-1996.pdf

ws/T67-19964.55,5-联疏代-双-2-硝基苯甲酸(DTNB)溶液：称取19.8 mg DTNB,滴加磷酸盐缓冲液(4.2)，搅拌，直至完全溶解，溶液透明（大约加2mL),再用生理盐水(4.3）稀释至10mL,置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。出现黄色即弃用。4.6抑制剂-毒扁豆碱：取1mg左右柳酸毒扁豆碱，溶于0.5mL生理盐水(4.3)，临用时配制，严防污染其他试剂及器材。4.71mmol/L谷胱甘肽标准溶液：精确称取3.07mg还原型谷胱甘肽用水溶解，移入10mL容量瓶中，稀释至刻度。此液1mL相当于14mol谷胱甘肽。因其易被氧化，应于用时配制，水必须先经煮沸去氧冷却后使用。5采样、运输和保存取末梢血滴入置有肝素抗凝剂的小试管中混匀备用，或取10L末梢血直接加到盛有3mLpH7.40的磷酸缓冲液(4.2)的小试管中，混匀，加塞，置冰瓶中运送，于4冰箱内保存，尽快分析。6分析步骤6.1标准曲线的绘制：取5支试管按下表配制标准管。标准管的配制伊号0123谷胱甘肚标准溶液(4.7)，mL00.10.20,30.4水，mL0.50.40.30.20.1缓冲液(4.2)，mL1.51.51.51.51.5DTNB溶液(4.5)，mL0.50.50.50.50.5胆碱酯酶活性单位，mol/mL(37C,6min)020406080以水为参比，5mm厚比色杯在412nm波长处读取吸光度，用各标准系列管的吸光度，分别减去零管吸光度之值，作为纵坐标，酶活性单位为横坐标，绘制标准曲线。6.2样品测定取末梢血104L,放入盛有3mL磷酸盐缓冲液(4.2)的小试管中，混匀后，取出1.5mL置于另一小试管中，作测定管，原管作对照管。向对照管中加入一滴抑制剂液(4.6)，混匀。将两管同置37水浴中预温510min(视室温而定).向两管中分别加入已在37水浴保温的DTNB应用液(4.5)和ASCh应用液(4.4)各0.5mL。加入ASCh液时，立即计时并混匀。在37水浴中准确反应6min后，即向测定管中加入一小滴抑制剂液(4.6)，混匀以终止反应。离心除去血细胞，取上清液，放入5mm比色杯，于分光光度计上412nm波长处，以水为参比，读取吸光度A:对照管的吸光度为A。A减去A得吸光度差A,即为酶水解基质产生的硫代胆碱的显色深度，查标准曲线可得全血胆碱酯酶活性单位。7计算测定人血样品时，以每毫升血样在37温浴6min,水解1微克分子（mol)基质为1单位。14mol谷胱甘肽能提供1mol巯基，其显色效应相当于14mol硫代胆碱，也相当于酶促使分解1mol基质（乙酰硫代胆碱）的效应。现测定管取血量为0.005mL,温浴时间为6min。每1mL巯基标准液含谷胱甘肽14mol,故显色效应相当于0.1mL巯基标准液的酶活性单位为：11kmol/amL0.1nmL0.005mL=20单位式中：0.1mL一巯基标准应用液的用量，如果是0.2mL巯基标准应用液就相当于40单位，余类推；0.005mL一血样量。