基于转录组分析植物乳杆菌A...5在亚油酸胁迫下的生理响应_窦慧.pdf

第 3 期第 53 卷基金项目：国家自然科学基金（32101922）；上海市教育委员会科研创新项目（2101070007800120）；上海市扬帆计划（20YF1433500）；上海食品微生物工程技术研究中心（19DZ2281100）。第一作者：窦慧（1997），女，硕士，研究方向：食品微生物。E-mail:。*通讯作者：刘欣欣，研究方向：食品微生物。E-mail:。基于转录组分析植物乳杆菌 AR195 在亚油酸胁迫下的生理响应窦慧，衡利冰，王光强，熊智强，夏永军，艾连中，刘欣欣*上海理工大学健康科学与工程学院，上海食品微生物工程技术研究中心，上海 200093摘要：植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）和共轭亚油酸（CLA，Conjugated linoleic acid）均具有良好的益生特性和保健功能。目前人们已经明确了植物乳杆菌 CLA 生物合成的途径，但仍然缺乏对底物亚油酸（Linoleic acid，LA）响应机制的研究。文章基于转录组学分析了 LA 对植物乳杆菌 AR195 生长和基因表达的影响，结果表明 LA 能够抑制 AR195 的生长，添加 LA 后 AR195 中157 个基因上调，67 个基因下调，差异表达基因在代谢、环境信息处理和细胞过程等 KEGG 通路中富集。LA 毒性主要来自于生长抑制和氧化还原失衡，而 AR195 可通过维持氧化还原平衡、生物转化 CLA、增强碳源摄取及代谢、全局转录调控等生理响应过程缓解 LA 毒性。文章首次提出植物乳杆菌 AR195 应对 LA 胁迫的分子机制，为植物乳杆菌对 LA 的应激响应及 CLA 合成的内在动因提供了新的见解。关键词：转录组分析；亚油酸（LA）；植物乳杆菌；氧化应激；共轭亚油酸（CLA）doi：10.3969/j.issn.1001-6678.2023.03.030第 53 卷第 3 期2023 年 6 月工业微生物Industrial MicrobiologyVol.53 No.3Jun.2023亚油酸（Linoleic acid，LA，顺,顺-9,12-十八碳二烯酸）是人和动物所需营养中必不可少的一种不饱和脂肪酸，通常以甘油酯的形式存在于动植物油脂中。LA 常作为细胞膜的结构成分出现，同时也是体内参与重要生理过程的前体物质之一。瘤胃微生物、丙酸杆菌和乳酸菌等都可以将亚油酸转化为共轭亚油酸（CLA，Conjugated linoleic acid），其中植物乳杆菌是一种来源安全的益生菌1-3，具有完整的亚油酸异构酶编码基因和良好的 CLA 合成能力。CLA因其具有清除自由基、增强人体抗氧化能力和免疫力、抗癌作用、代谢调节活性等潜在生理活性而成为近年的研究热点4-5，而 LA 也常常作为微生物合成CLA 所需的前体物质参与研究。目前有关 LA 的研究大多集中在 LA 向 CLA 生物转化的过程上。植物乳杆菌以 10-羟基-顺-12-十八烯酸、10-氧-顺-12-十八烯酸和 10-氧-反-11-十八烯酸为中间体将 LA 转化为 CLA，此过程由cla-hy、cla-dh、cla-er 和 cla-dc 编码的三组分亚油酸异构酶系统催化完成6。近期研究表明，植物乳杆菌菌株的 CLA 生物转化能力显著依赖于 cla-hy、cla-dh 和 cla-dc 的转录维持，当 cla-dh 和 cla-dc 的转录上调且在平台期保持较高的转录水平时，CLA的产生与 cla-hy 转录水平的增加呈正相关关系7-8。尽管研究者对 CLA 的生理作用和植物乳杆菌的CLA 合成机制已经有了较为深入且全面的研究，但是关于植物乳杆菌应对 LA胁迫的机制尚不明晰。过往的研究已表明 LA 会抑制菌株生长，一些研究也侧面报道了 LA 对细菌的生理作用及可能的作用机制。Koppov 等发现 LA 浓度会影响瘤胃细菌生长的迟滞期长度9。Fontes 等发现在加有 LA 的半脱脂牛奶中生长的双歧杆菌 NCIMB 702258，其细胞膜组成发生了改变10。虽然细菌生成 CLA 是应对127-第 3 期第 53 卷工业微生物LA 毒性的观点已被广泛认可，但关于 LA 对植物乳杆菌基因表达的影响信息仍非常有限，目前在植物乳杆菌中 LA 应激耐受的潜在机制也在很大程度上存在未知。本研究所在实验室在前期筛获一株高产 CLA的植物乳杆菌 AR195，因此以 AR195 为研究对象并利用转录组学分析揭示 AR195 在游离 LA 胁迫下的生理响应，提出了植物乳杆菌应对 LA 胁迫的可能机制：游离 LA 抑制 AR195 生长，并导致胞内氧化还原失衡；AR195 通过将 LA 转化为 CLA、合成抗氧化物质、修复氧化损伤蛋白、维持氧化还原平衡、增加碳源摄取、增加丙酮酸及半乳糖代谢、全局转录调控等途径来响应 LA 胁迫。本研究从转录水平层面分析了 LA 对植物乳杆菌 AR195 生长的影响，并首次提出植物乳杆菌 AR195 应对 LA 胁迫的分子机制。研究结果为植物乳杆菌 AR195 对 LA 的应激响应和 CLA 合成动机提供了新的见解，能够为理解植物乳杆菌应对 LA胁迫的反应机制提供数据支持。1材料与方法1.1菌株和培养条件植物乳杆菌 AR195 是本课题组获得并完成全基因组测序的 CLA 高产菌株，序列数据已提交到GenBank 数据库，登录号为 PRJNA706544。使用保菌管中的菌种在 MRS 固体平板上划线，于 37 C 厌氧环境中培养 1224 h；挑取单菌落接种于液体培养基中培养活化 12 h 左右，活化好的菌株用于下一步实验。菌种保藏时将菌液与 40%的甘油 11 混合在冰箱中-80 存放。1.2生长曲线测量将 AR195 接种在 MRS 固体平板上，37 环境中培养 12 h；挑取单菌落接种在 MRS 液体培养基中，37 环境中培养 12 h。将种子培养物以 1%（V/V）的浓度接种到含不同浓度 LA 的 MRS 培养基中，混合均匀，每个细胞悬液都加 200 L 到多孔板上，37 C 环境中培养 24 h。使用 Bioscreen C Pro 系统（Oy Growth Curves Ab Ltd，芬兰）在 600 nm 处每隔30 min 测量一次光密度（OD600），并绘制生长曲线。1.3RNA 提取采用 Trizol 法（天根生物技术）在对数期（8 h）对菌株进行 RNA 提取。RNA 浓度由 Nanodrop 2000分光光度计（赛默飞世尔科学公司）测定，RNA 完整性用琼脂糖凝胶电泳检测。使用 PrimeScript RT 试剂盒（TaKaRa，日本）将总 RNA（1 ng）逆转为 cDNA。1.4实时荧光定量 PCR在实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）体系中加入50 g 的 cDNA，总体积为 20 L，采用 Hieff UniconPower qPCR SYBR green master mix（翌圣生物科技（上海）股份有限公司）进行定量 PCR。每个 PCR 都在 LightCycler 96 qRT-PCR 系统（Roche Diagnostics）中进行。PCR 过程如下：95 变性 5 s，60 退火30 s，循环 40 次，在每种条件下分别进行 3 次重复实验；16s rRNA 作为内参基因。使用 LightCycler 96分析系统对数据进行分析，并采用 2-CT法计算相对表达倍数。1.5RNA-seq 分析基因数据将 MRS 培养基中的植物乳杆菌 AR195 分别在不添加（0 mg/mL LA）和添加 LA（1 mg/mL LA）两种条件下培养。培养物一式三份，在对数期（8 h）取培养物于室温下离心（10 000 g，1 min），于液氮中速冻后置于-80 环境中保存，用于转录组分析。RNA 测序采用 Illumina Hiseq 4000 平台（美吉生物技术有限公司，中国上海）。转录组测序原始数据已提交到GenBank 数据库，登录号为 PRJNA907523。以Padjust 0.05、|log 2 FC|1 为阈值，AR195 与 LA共培养过程中共鉴定出 157 个差异表达基因（Differentially expressed gene，DEG）。文中提及的所有差异表达基因均符合 P 0.05 的条件，因此显著性值不需再赘述。RNA-seq 数据在 Majorbio 云平台上（）进行分析，用于基因注释的数据库是 KEGG 数据库（KEGG：Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes）。经测序质量控制本研究共获得 20.7 Gb 质控数据，所有样品质控数据均达到 2.97 Gb 以上，Q30 碱基百分比在 95.27%以上。由于参考基因组的核糖体RNA 污染率小于 0.15%，所以样品各项检测参数均达到质量要求。质控数据及 qPCR 验证结果表明转录组测序结果可信度较高，可进行后续深度分析。2结果128-第 3 期第 53 卷2.1LA 对植物乳杆菌生长的影响为考察 LA 对植物乳杆菌 AR195 生长的影响，本研究测试了不同浓度 LA 对 AR195 生长曲线的影响。如图 1-A 所示，MRS 培养基中加入 0.3 mg/mL的 LA，对 AR195 的生长无明显抑制作用；当 LA 浓度达到 1.5 mg/mL 时，生物量下降约 50%；当 LA 处于最高浓度（2.7 mg/mL）时，AR195 几乎不生长。绘制在培养 6 h 和 20 h 两个时间点下不同 LA 浓度与OD600的对应关系，能够发现 LA 浓度与生物量呈现出较强的负相关关系（图 1-B），LA 会抑制植物乳杆菌 AR195 的生长，且浓度越高，抑制效果越强。2.2转录组分析本实验基于 RNA-seq 测定了含/不含 LA 两种条件下的 AR195 基因表达情况，结果如图 2 所示。转录组测序表明两组有 3 175 个共同表达的mRNA，MRS 组与 MRS-LA 组各有 21 个特有表达基因（见图 2-A）。MRS-LA 组与 MRS 组相比有 157个基因上调，67 个基因下调（见图 2-B），LA 胁迫使基因表达在代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程等通路中显著富集，在核苷酸代谢（14 个下调基因，5 个上调基因）、碳水化合物代谢（10 个上调基因）、氨基酸代谢（5 个上调基因，4 个下调基因）、信号转导（10 个上调基因）等二级通路中显著富集（见图 2-C），其中下调基因主要为与嘌呤代谢相关的基因。在 KEGG 通路中，代谢通路变化最大，包含54 个差异表达基因，占差异表达基因总数的 24%，除核苷酸代谢、氨基酸代谢、碳水化合物代谢等基因外，还包括脂代谢和能量代谢上调的基因cla-dc、ItaS、ar2242 和 cysEK、ar0240、ar0242 等。总之，LA 扰乱了植物乳杆菌菌株的整体基因表达，改变了AR195 的整体代谢情况。2.3LA 诱导植物乳杆菌 AR195 发生氧化还原反应活性氧具有破坏和作为信号转导生物分子的双重作用，环境胁迫（如温度、pH 和渗透压等超过植物忍耐极限）会促使细胞内产生活性氧（ROS），内源性ROS 的产生也是激活应激反应的细胞内通信系统的必要组成部分。调控蛋白 OhrR 可以感知 ROS 并调控氧化应激反应，其基因表达量上调 4.6 倍，说明LA 胁迫导致 AR195 活性氧水平升高。此外，多个与氧化还原相关的基因表达水平均呈现上调趋势，包括用于修复氧化损伤蛋白的硫氧还蛋白编码基因trxA；参与半胱氨酸、硫代半胱氨酸、脯氨酸合成的基因 metC、cysE、cysF、pip；硫转移酶编码基因 thiI。活性氧感知蛋白和氧化损伤修复蛋白对应的编码基因受到 LA 胁迫后表达水平上调，说明游离 LA 引发AR195 氧化还原失衡。metC、cysE、cysF、pip 等基因涉及半胱氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢，而这些氨基酸代