基于ISSR与SCoT分子...性分析及DNA指纹图谱构建_杨天为.pdf

分子植物育种，2023 年，第 21 卷，第 14 期，第 4710-4718 页Molecular Plant Breeding,2023,Vol.21,No.14,4710-4718研究报告Research Report基于 ISSR 与 SCoT 分子标记的赤苍藤种质遗传多样性分析及 DNA 指纹图谱构建杨天为1黄诗宇1张尚文1*高曼熔2张向军1李婷1庾韦花1蒙平1石前11 广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所,南宁,530007;2 广西大学农学院,南宁,530004*通信作者,摘要为了选育赤苍藤优良品种，本研究利用 ISSR 与 SCoT 分子标记技术对 24 份赤苍藤种质资源进行遗传多样性分析。结果表明，11 条 ISSR 引物共扩增出 91 个条带，其中多态性带条 73 个，平均每条引物扩增多态性条带 6.6 个；10 条 SCoT 引物共扩增出 102 个条带，其中多态性条带 86 个，平均每条引物扩增多态性条带 8.6 个。基于 ISSR 与 SCoT 标记的遗传相似系数的范围分别是 0.560 40.857 1 和 0.529 40.882 4，说明赤苍藤种内具有较为丰富的遗传变异，其遗传多样性的表现与地理位置的相关性不显著。ISSR 与 SCoT 标记分别在遗传相似系数 0.72 和 0.69 处可将 24 份赤苍藤种质聚为 3 类，两种分子标记的聚类结果基本相同。此外，在此研究基础上通过 2 条 ISSR 引物组合(UBC824,UBC827)和 2 条 SCoT 引物组合(SCoT-2,SCoT-27)分别构建了赤苍藤种质的 DNA 指纹图谱。本研究为赤苍藤种质资源的保护与利用、品种的鉴定与分类、选育与改良提供了理论依据。关键词赤苍藤;ISSR;SCoT;遗传多样性;指纹图谱Genetic Diversity Analysis and DNA Fingerprinting of E.scandens Germ-plasm Based on ISSR and SCoT Molecular MarkersYang Tianwei1Huang Shiyu1Zhang Shangwen1*Gao Manrong2Zhang Xiangjun1Li Ting1Yu Wei-hua1Meng Ping1Shi Qian11 Biotechnology Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning,530007;2 College of Agriculture,Guangxi University,Nan-ning,530004*Corresponding author,DOI:10.13271/j.mpb.021.004710AbstractIn order to breed superior variety of Erythropalum scandens Blume,ISSR and SCoT markers were usedto analyze the genetic diversity of 24 germplasms in this study.The results showed that 91 bands were amplifiedby 11 ISSR primers,including 73 polymorphic bands,with an average of 6.6 polymorphic bands.102 bands wereamplified by 10 SCoT primers,including 86 polymorphic bands,with an average of 8.6 polymorphic bands.Thegenetic similarity coefficients ranged from 0.560 4 to 0.857 1 and 0.529 4 to 0.882 4 based on ISSR and SCoTmarkers,indicating that there were abundant genetic variations within the species,the correlation between geneticdiversity and geographical location was not significant.24 germplasms could be divided into 3 groups at the gene-tic similarity coefficients of 0.72 and 0.69 base on ISSR and SCoT markers.The clustering results of the two mar-基金项目：本研究由广西重点研发计划项目(桂科 AB21220042)、广西农业科学院基本科研业务专项(桂农科 2017YM27;桂农科2022JM51)、广西特色作物试验站“广西隆安中草药试验站”(桂 TS2022002)和广西水土保持学会重点领域创新项目(202009001)共同资助引用格式：Yang T.W.,Huang S.Y.,Zhang S.W.,Gao M.R.,Zhang X.J.,Li T.,Yu W.H.,Meng P.,and Shi Q.,2023,Genetic diversityanalysis and DNA fingerprinting of E.scandens germplasm based on ISSR and SCoT molecular markers,Fenzi Zhiwu Yuzhong(MolecularPlant Breeding),21(14):4710-4718.(杨天为,黄诗宇,张尚文,高曼熔,张向军,李婷,庾韦花,蒙平,石前,2023,基于 ISSR与 SCoT 分子标记的赤苍藤种质遗传多样性分析及 DNA 指纹图谱构建,分子植物育种,21(14):4710-4718.)kers are roughly the same.In addition,two ISSR primers(UBC824,UBC827)and two SCoT primers(SCoT-2,SCoT-27)were used to construct the DNA fingerprints of Erythropalum scandens Blume.The study result pro-vides a theoretical basis for the protection and utilization of germplasm resources,identification and classificationof varieties,and breeding of Erythropalum scandens Blume.KeywordsErythropalum scandens Blume;ISSR;SCoT;Genetic diversity;Fingerprint图 1 24 份赤苍藤种质的 DNA 电泳检测注:M:DL2000 DNA Marker;124:124 号赤苍藤种质 DNAFigure 1 DNA electrophoresis detection of 24 germplasms ofErythropalum scandens BlumeNote:M:DL2000 DNA Marker;124:124 germplasm DNA ofErythropalum scandens Blume赤苍藤(Erythropalum scandens Blume)是铁青树科赤苍藤属多年生藤本植物，具有较高的食用、药用、生态保护价值，主要分布于热带及亚热带地区，在中国主要分布于广西、广东、云南、贵州等地。赤苍藤是一种安全可靠的药食同源的蔬菜，中国民间有将其作为蔬菜食用的习俗(张尚文等,2020)，当前赤苍藤作为一种鲜食蔬菜已经开始走进大众消费市场。由于种植户主要依靠砍伐野生赤苍藤枝条进行扦插繁殖，且繁育技术尚不成熟，导致成活率低，难以满足市场对赤苍藤的需求(黄诗宇等,2021)。由于赤苍藤分布范围较为狭窄，且野生资源破坏严重，导致种质资源的收集较为困难，所以有关赤苍藤种质资源分析研究的报道较少，无法高效开展种质资源保护和种苗繁育工作。因此，开展赤苍藤遗传多样性的研究对种质资源的收集与保护、评价与高效利用以及品种的改良与选育具有重要意义。分子标记是研究物种遗传多样性的重要手段之一，已经被广泛运用于多种植物，常用的分子标记有SSR(Simple sequence repeat)、ISSR(Inter simple se-quence repeats)、SCoT(Start codon targeted polymor-phism)、RAPD(Random amplified polymorphic DNA)等(龙治坚等,2015;Sirangi et al.,2020;王永峰,2021)，其中 ISSR 是一种扩增简单重复序列区间的分子标记，该技术具有多态性丰富、稳定性好、成本低、操作简单等优点(Azevedo et al.,2011;Trieu et al.,2016)，已经被成功应用在两面针(向巧彦等,2014)、油茶(肖璞,2019)、甘草(王莉莉等,2021)、铁皮石斛(杨琴,2021)等植物的遗传多样性研究。SCoT 是一种根据基因组DNA 中翻译起始位点 ATG 的侧翼有一段短的保守序列的原理进行单引物扩增的分子标记(Collard andMackill,2009)，其与 ISSR 的区别在于 SCoT 能够扩增与功能基因相关联的条带，反映相关功能基因的多态性，已经被应用于多种植物的遗传多样性(尚小红等,2019)、亲缘关系(张天翔等,2021;齐贝贝等,2022)等研究。在 ISSR 与 SCoT 的研究基础上可以进一步构建赤苍藤 DNA 指纹图谱，目前番木瓜(杨祥燕等,2013)、猕猴桃(齐少玮等,2019)、小麦(刘若楠,2020)、铁皮石斛(杨琴,2021)、燕麦(李进等,2021)等植物已经通过 ISSR 或 SCoT 分子标记成功构建不同种质的指纹图谱。由于不同的分子标记经过聚类分析获得的结果可能存在差异(肖璞,2019;高傲等,2021)，而 ISSR 与SCoT 分子标记的通用引物均已公布，不需要重新设计引物，方法简便、快捷。因此，本研究以 24 份不同来源地的赤苍藤种质为试验材料，通过 ISSR 和SCoT两种分子标记技术对赤苍藤在分子层面开展遗传多样性研究，综合比较聚类分析结果，分析两种分子标记技术应用于赤苍藤的可行性，提供科学、可靠的理论依据，并在此基础上构建赤苍藤 DNA 指纹图谱，为赤苍藤种质资源的保护与利用、品种的鉴定与分类、选育与改良提供理论指导。1结果与分析1.1赤苍藤基因组DNA检测结果24 份赤苍藤样品的 DNA 的 OD 值(A260/A280)为1.801.99，浓度为 333.12266.5ng/L，经 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带且无明显拖带(图 1)，说明提取的 DNA质量较好，可用于 SCoT 和 ISSR标记。1.2 ISSR与SCoT扩增多态性分析从 40 条 ISSR 引物和 36 条 SCoT 引物中分别筛选到 11 和 10 条背景清晰、稳定性好、多态性丰富的引物(表 1;表 2)，对部分引物进行扩增(图 2;图 3)。11条 ISSR 引物在 24 份赤苍藤材料中共扩增出 91 个基因位点，其中多态性位点 73 个，占总位点 80.22%，平均每条引物扩增出 8.3 个位点，其中 UBC827、UBC-834、UBC836 引物多态性位点百分率达 1