邻二氮菲分光光度法测定稻米中的植酸含量_贺为毅.pdf

湖南农业大学学报(自然科学版)2023，49(3)：377382DOI：10.13331/ki.jhau.2023.03.018Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)引用格式：贺为毅，王葵，彭晓赟，黄明春，萧浪涛，刘登友，王若仲 邻二氮菲分光光度法测定稻米中的植酸含量J 湖南农业大学学报(自然科学版)，2023，49(3)：377382HE WY，WANG K，PENG X Y，HUANG M C，XIAO LT，LIU D Y，WANG R ZDetermination of phyticacid content in rice by 1,10-phenanthroline spectrophotometryJ Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(3)：377382投稿网址：http:/邻二氮菲分光光度法测定稻米中的植酸含量贺为毅1,2，王葵1,2，彭晓赟1,2，黄明春4，萧浪涛1,2，刘登友3，王若仲1,2*(1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.植物激素与生长发育湖南省重点实验室，湖南 长沙410128；3.湖南农业大学化学与材料学院，湖南 长沙 410128；4.湖南省衡阳县农业农村局，湖南 衡阳 421200)摘要：建立了一种邻二氮菲分光光度法测定稻米植酸含量的方法：加入过量 Fe3+与植酸生成 41PA(Fe)4沉淀，再利用盐酸羟胺将剩余 Fe3+还原为 Fe2+，以邻二氮菲为显色剂，采用分光光度法定量检测 Fe2+，从而实现对稻米植酸含量的检测。对测定体系的 pH 和反应时间进行优化，分析无机磷酸对植酸含量测定的影响，验证方法的重复性和精确度。结果表明：在溶液 pH为 2.5、反应时间为30 min条件下，可准确测定的植酸浓度为6.71072.5105mol/L，低浓度和高浓度植酸测定工作曲线的 R2均大于 0.99；无机磷酸浓度低于 2.0105mol/L 时，游离的无机磷酸对植酸检测无影响；对 6.71072.5105mol/L 的标准样品进行 5 次平行试验，回收率为 93.30%104.67%，RSD 为 1.25%7.34%。利用该方法测定的黄华占、金穗 408、Kitaake、日本晴等 4 个品种的稻米植酸含量分别为5.42、4.72、6.40、5.68 mg/g，RSD 为 1.23%7.60%。关键词：稻米；植酸；分光光度法；邻二氮菲中图分类号：TS207.3；O657.32文献标志码：A文章编号：1007-1032(2023)03-0377-06Determination of phytic acid content in rice by1,10-phenanthroline spectrophotometryHE Weiyi1,2，WANG Kui1,2，PENG Xiaoyun1,2，HUANG Mingchun4，XIAO Langtao1,2，LIU Dengyou3，WANG Ruozhong1,2*(1.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan 410128,China;2.HunanProvincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development,Changsha,Hunan 410128,China;3.School ofChemistry and Materials Science,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan 410128,China;4.Agriculture andRural Bureau of Hengyang County,Hengyang,Hunan 421200,China)Abstract:In this study,a 1,10-phenanthroline spectrophotometry for the determination of phytic acid content in rice wasestablished.The protocol included three steps,first add excess Fe3+and phytic acid to form 41 PA(Fe)4precipitation,then use hydroxylamine hydrochloride to reduce the remaining Fe3+to Fe2+,after that use 1,10-phenanthroline as a colordeveloper to quantitatively detect Fe2+by spectrophotometry,and finish the detection of phytic acid content in rice.ThepH and reaction time of the determination system was optimized,and analyze the effect of inorganic phosphoric acid onthe determination of phytic acid content,the reproducibility and accuracy of the method were verified.The resultsshowed that the phytic acid concentration could be accurately determined in the range of 6.710-7-2.510-5mol/L underthe pH 2.5 and reaction time was 30 min,and the R2of the working curves for the determination of phytic acid at low and收稿日期：20220210修回日期：20230606基金项目：国家自然科学基金项目(31871714、31671777)；湖南省教育厅项目(19A221)作者简介：贺为毅(1996)，男，湖南长沙人，硕士研究生，主要从事植物生理学研究，；*通信作者，王若仲，博士，教授，主要从事植物生理学研究，378湖南农业大学学报(自然科学版)http:/2023 年 6 月high concentrations were greater than 0.99.The free inorganic phosphate did not affect the detection of phytic acid whenthe inorganic phosphate concentration was lower than 2.010-5mol/L.The recoveries were 93.30%-104.67%and theRSD of 1.25%-7.34%for five parallel tests on standard samples of 6.710-7-2.510-5mol/L.The phytic acid contents ofthe rice of four varieties,including Huanghuazhan,Jinsuo408,Kitaake and Nipponbare,determined by this method were5.42,4.72,6.40,5.68 mg/g,the RSD were 1.23%to 7.60%.Keywords:rice;phytic acid;spectrophotometry;1,10-phenanthroline植酸又名肌醇六磷酸，含有 6 个磷酸基团，呈强酸性，是植物体内重要的含磷化合物之一1。成熟的植物种子或营养体中约 60%80%的有机磷以植酸和植酸盐的形式存在。植酸作为强螯合剂，可与植物中的铁、锌、钙等金属阳离子形成稳定的植酸盐2。种子萌发过程中，植酸盐在植酸酶作用下释放出磷离子和低磷酸肌醇供给胚发育和幼苗生长3，且此过程中的物质代谢和能量转化均与磷、含磷有机物密切相关，如 DNA 合成、细胞膜磷脂双分子层的形成4。此外，植酸还为植物生长发育提供营养，参与 mRNA 转运，与 Gle 蛋白协同将mRNA 由细胞核内向核外转运，响应逆境胁迫，调节磷信号转导，促进内环境的稳态，DNA 修复和种子发育等5。植酸的检测方法主要有滴定法、高效液相色谱法、分光光度法、离子色谱法等。滴定法主要有三氯化铁滴定法6和硝酸钍滴定法7，滴定法操作简单，但其滴定终点难以掌握，对操作的熟练度要求高，且精密度低。高效液相色谱法8检测灵敏度高，但所需仪器设备昂贵，检测成本高，且强酸性的植酸易腐蚀检测体系。离子色谱法9对使用的树脂要求过高，洗脱过程繁琐。分光光度法主要有磺基水杨酸铁比色法10，因其能实现快速测定而被广泛采用，但其灵敏度尚有待提高。邻二氮菲作为显色剂，其摩尔吸光系数是磺基水杨酸的近 2 倍11，且用邻二氮菲分光光度法测定 Fe2+具有高灵敏性和好的线性范围12。植酸与 Fe3+定量反应生成沉淀，Fe3+/Fe2+具有良好的可逆性，还原剂能将 Fe3+迅速还原为Fe2+。为了进一步提高分光光度法测定植酸的灵敏度，笔者从显色剂的选择上开展相关研究，通过加入适度过量且已知浓度的 Fe3+标准溶液与植酸生成41PA(Fe)4沉淀，离心去除沉淀后，再以盐酸羟胺为还原剂将剩余 Fe3+迅速还原为 Fe2+，采用邻二氮菲分光光度法测其剩余的 Fe2+，从而实现对植酸的定量检测。笔者还对测定体系的 pH 和反应时间进行优化，分析无机磷酸对植酸含量测定的影响，验证方法的重复性和精确度，最后将该法应用于测定稻米样品中的植酸含量。1材料与方法1.1材料供试水稻种子有黄华占、金穗 408、Kitaake、日本晴。主要试剂有 Fe2(SO4)3、植酸钠、0.15 g/L 邻二氮菲溶液、1.0 mol/L 乙酸钠、0.1 mol/L 盐酸羟胺、0.5 mol/L 硫酸钠。主要仪器有 SPARK 型多功能酶标仪(瑞士Tecan)、AUX220 型分析天平(日本 SHIMADZU)、FE28 型 pH 计(瑞士 METTLER TOLEDO)。1.2方法1.2.1标准溶液的配制1.0103、1.0102mol/L Fe3+标准溶液的配制：分别称取 Fe2(SO4)30.100 0、1.000 0 g 于烧杯中，用去离子水溶解，再加入 1.0 mL 浓硫酸，最后定容至500 mL，配制成浓度为 1.0103、1.0102mol/L 的Fe3+标准储备液，于 4 冰箱保存，备用。1.0103mol/L 植酸标准溶液的配制：称取植酸钠 0.461 9 g 于烧杯中，用去离子水溶解后定容至500 mL，配制成浓度为 1.0103mol/L 的标准溶液，于 4 冰箱保存，备用。1.2.2邻二氮菲分光光度法测定 Fe3+浓度本研究要建立的方法是通过测定 Fe3+含量，从而间接计算出植酸含量，考查 Fe3+的浓度(C)与吸光度值(A)的线性关系是准确测定 Fe3+浓度的基础。取8 支 10 mL 试管，其中 4 支试管分别加入 6、18、30、300 L 的 1.0103mol/L 的 Fe3+标准溶液，另 4支试管分别加入 60、90、300、480 L 的 1.0102mol/L 的 Fe3+标准溶液，使 Fe3+终浓度为 2.0106、第 49 卷第 3 期贺为毅等邻二氮菲分光光度法