抗松材线虫病马尾松种源的抗性相关基因分析_郑华英.pdf

收稿日期:2022-06-14 基金项目:国家重点研发计划(2017YFD0600104)资助。作者简介:郑华英，博士，副研究员。E-mail：*通信作者:解春霞，研究员。E-mail： 安徽农业大学学报,2023,50(3):379-388 Journal of Anhui Agricultural University DOI 10.13610/ki.1672-352x.20230625.006 网络出版时间：2023-06-26 16:19:55 URL https:/ 抗松材线虫病马尾松种源的抗性相关基因分析 郑华英1，徐丽丽1，解春霞1*，刘云鹏1，叶建仁2(1.江苏省林业科学研究院，南京 211153；2.南京林业大学林学院，南京 210037)摘 要：为了从转录组水平探讨抗病马尾松种源对松材线虫的响应机制。以抗病马尾松 GD5 种源为试验材料，普通马尾松 SX1 种源为对照，利用 RNA-seq 技术通过 Illumina 高通量测序平台对松材线虫诱导前后的试验材料进行转录组测序和差异基因表达分析。试验共获得 65 889 条 unigenes，平均长度为 906.85 bp，其中 40 478 条（61.43%）unigenes 基于 Nr、GO、COG、KEGG 等多个公共数据库获得了功能注释。抗病马尾松 GD5 种源在接种松材线虫后差异表达基因数量为 3 247 条，包括 2 308 条基因表达显著上调，939 条基因表达显著下调。其中有 1 961 条（60.39%）差异表达基因被注释到 GO 数据库中，有 504 条（15.52%）差异表达基因被注释到 233 条 pathway。普通马尾松 SX1 种源在松材线虫诱导过程中产生了更多的差异表达基因。两个马尾松种源富集的 GO 条目和 pathway差异也较大。抗病马尾松 GD5 种源体内编码醛脱氢酶的 5 条基因和编码超氧化物歧化酶、过氧化物酶体原蛋白以及细胞色素 b2 的基因表达均显著上调，醛脱氢酶基因不仅富集于抗坏血酸和醛酸代谢途径中，还参与-丙氨酸、赖氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸等氨基酸的代谢途径；参与氨基糖和核苷酸糖代谢途径的 6 条几丁质酶基因表达均显著上调；参与单萜生物合成的短链脱氢酶/还原酶 2b 及参与倍半萜和三萜生物合成的长叶烯合酶基因表达均显著上调，而参与二萜类生物合成的 1(10),5-格玛吖啶-4-醇合酶、萜烯合酶、-松油醇合酶、异丙二烯合酶以及 2-甲基-3-丁烯-2-醇合酶等表达均显著下调。抗病马尾松 GD5 种源对松材线虫的胁迫响应是多基因和多信号途径共同参与调控的复杂防御反应，是全局性系统性的响应模式。与抗性相关的醛脱氢酶、几丁质酶等编码基因为后期相关抗性基因的研究提供了参考。关键词：抗病马尾松种源；松材线虫病；转录组测序；抗性基因 中图分类号：S791.248 文献标识码：A 文章编号：1672-352X(2023)03-0379-10 Analysis of resistance genes in Pinus massoniana provenances against pine wood nematode disease ZHENG Huaying1，XU Lili1，XIE Chunxia1，LIU Yunpeng1，YE Jianren2(1.Jiangsu Academy of Forestry,Nanjing 211153;2.School of Forestry,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037)Abstract:To investigate the response mechanism of PWD-resistant Pinus massoniana provenance to pine wood nematode at transcriptome level.Using disease-resistant provenance-GD5 of P.massoniana as test materials and normal provenance-SX1 of P.massoniana as control,the transcriptome profiles analysis of test materials before and after infected by Bursaphelenchus xylophilus were sequenced by RNA-seq technology using Illumina se-quencing platform,and the differentially expressed genes were analyzed.The result showed that:65 889 unigenes were obtained,of which 40 478(61.43%)unigenes were identified in NR,GO,KEGG,Swiss-Prot COG and the other databases in total.The average length is 906.85 bp.In GD5,the number of differentially expressed genes(DEGs)were 3 247,including 2 308 up-regulated genes and 939 down-regulated genes,1 961 DEGs（60.39%）were annotated into the go database and 504 DEGs（15.52%）were annotated into 233 pathways.SX1 occupied more DEGs after infected by B.xylophilus.The GO and KEGG terms exhibited big differences between the two provenance pines.Aldehyde dehydrogenase,superoxide dismutase,peroxisome biogenesis protein 1 and cyto-chrome b2,mitochondrial-like were significantly up-regulated.The aldehyde dehydrogenase genes were not only 380 安 徽 农 业 大 学 学 报 2023 年 enriched in ascorbic acid and aldehyde metabolism pathway,but also involved in the metabolism of amino acids such as -alanine,lysine,tryptophan,valine,leucine,isoleucine,histidine,arginine and proline.Six chitinase genes involved in the metabolism of amino sugar and nucleotide sugar were significantly up-regulated.Dehydro-genase/reductase 2b-like involved in monoterpenoid biosynthesis and longifolene synthetase involved in sesquit-erpenoid and triterpenoid biosynthesis were significantly up-regulated,while 1(10),5-germacradien-4-ol synthase,terpene synthase,-terpineol synthase,isopimaradiene synthase and 2-methyl-3-buten-2-ol synthase involved in diterpenoid biosynthesis were significantly down-regulated.The stress response of GD5 to pine wood nematode is a complex defense response that involves multiple genes and multiple signal pathways,and it is a global and sys-tematic response mode.The coding genes such as aldehyde dehydrogenase and chitinase related to resistance pro-vide a reference for the study of related resistance genes in the later stage.Key words:PWD-resistant Pinus massoniana provenance;Pine wood nematode disease;RNA-seq;Re-sistance genes 松材线虫病（pine wood nematode disease）是发生在松属（Pinus spp.）树种上的重大生物灾害之一，能够引起松树大量死亡。由于该病涉及到寄主松树、线虫、天牛、真菌、细菌以及环境因素等多个方面，至今其致病机理尚未完全弄清，对其治理也较为被动，无论是物理清除、化学治理、还是生物防控，都较难达到理想的预防控制效果。因而对树种本身的抗性差异进行研究，培育抗病松种（种源、品种、家系、无性系），可能成为松材线虫病最有希望的防治途径1。马尾松（P.massoniana）是中国松类中分布最广、资源最丰富的乡土树种，也是南方 19 省区重要的荒山脊地造林树种，受松材线虫病的侵染为害十分严重。有研究表明马尾松不同地理种源之间对松材线虫病的抗病性有着明显的差异2-4。徐福元等5-6经过十多年不定期接种观测试验，选出了来自不同地理区域的抗松材线虫病马尾松 GD5 等多个种源。对于马尾松的抗松材线虫病机制研究大多集中在生理生化层面，如萜类化合物、氨基酸等，而关于马尾松抗松材线虫病分子机制的研究报道较少。RNA-Seq 技术在植物抗病机制的研究中已得到广泛应用7-10，在植物与线虫互作的抗性机制研究方面也有很多成功的例子，如二穗短柄草（Brachypodium distachyon）与 禾 谷 孢 囊 线 虫（Heterodera avenae）11、大豆品种（Glycine spp.）与大豆胞囊线虫（H.glycines Ichinohe）12-15、桃砧木与南方根结线虫（Meloidogyne incongnita）16、马尾松无性系与松材线虫（Bursaphelenchus xy-lophilus）17-18等互作的抗性机制研究。本研究主要利用 RNA-seq 技术，通过 Illumina 高通量测序平台，以期从转录组水平揭示抗病马尾松 GD5 种源对松材线虫的应答机制，为选择具有抗性的马尾松种源育苗造林提供科学依据，也为今后可能开展的转基因育种打下理论基础。1 材料与方法 1.1 试验材料 以抗松材线虫病马尾松 GD5 种源为试验材料，普通马尾松 SX1 种源为对照。供试材料分别引自广东信宜和陕西固城，均为 2 年生实生苗。1.2 试验方法 1.2.1 松材线虫培养 用 PDA 培养基在培养箱（26 1）中培养灰葡萄孢菌（Botrytis cinerca），待灰葡萄孢菌长满培养皿