加减薯蓣丸调控Cx30_G...管性痴呆大鼠髓鞘损伤的研究_王建婷.pdf

？湖北中医药大学学报 年月第卷第期，加减薯蓣丸 调控通路改善血管性痴呆大鼠髓鞘损伤的研究王建停谭子虎周剑杰，王静鄢文静李贤炜（湖北中医药大学，湖北武汉；湖北省中医院，湖北 武汉）摘要：目的观察加减薯蓣丸（）对血管性痴呆（）模型大鼠海马髓鞘损伤的影响及其作用机制。方法选取级雄性大鼠只，随机分为假手术组、模型组、高、中、低剂量组，每组只。除假手术组外，其余组均采用双侧颈动脉结扎改良法进行模型制备，造模结束后通过水迷宫筛选造模成功大紐灌胃。高、中、低剂量姆胃剂量分别为、（），其衫膽予較生理盐水。灌胃结束后，通过新物体识别实验检测大鼠空间学习记忆能力，染色观察海马区神经元结构，生化检测海马区活性氧（）、超氧化物歧化酶（）、谷氨酸（）含量变化；固蓝染色（）检测海马区髓鞘结构变化，免疫荧光检测海马区少突胶质细胞转录因子（）、星 形胶质细胞标记物（）、半通道蛋白（）的表达，蛋白免疫印迹法（）检测海马区谷氨酸转运蛋白（）、甲基天冬氨酸受体（）、蛋白表达。结果与假手术组相比，模型大鼠新物体识别指数明显下降（）；海马神经元间 隙增大，细胞排列紊乱，胞质与胞核染色加深；髓鞘染色变淡，细胞结构松散；海马区、水平显著升高），水平明显降低（户）；荧光强度明显降低；、蛋白表达显著升高，蛋白表达显著降低（）。与模型组相比，给予干预后，大鼠新物体识别指数明显升高（）；神经元排列紧 密，胞质饱满，染色适中；隨鞘染色均匀且细胞排列紧 密；、水平显著降低，高、中剂量组最为明显（），高 剂量组水平较模型组明显升高（）；荧光强度增强；、蛋白表达明显降低（），蛋白表达显著升高（）。结论能改善大鼠学习记忆能力，其机制可能与减轻氧化应激反应，缓解星形肢质细胞损伤，抑制的表达，降低水平，促进少突谱系细胞的分化与成熟，从而减轻髓鞘损伤有关。关键词：血管性痴呆；加减薯蓣丸；疏鞘损伤中图分类号：文献标识码：，（，；，）：（），？，基金项目：湖北省自然科学基金重点项目（项目编 号：）。作者筒介：王建婷（），女，湖 北中医药大学中医临床学院 级博士研究生，研宄方向：中医药防治心脑血管疾病的研宂。通信作者：谭子虎（），男，湖 北中医药大学教授，研宄方向：中医药防治心脑血管疾病的研宄，：。年月第卷第期，湖北中医药大学学报？，（），（），（）？，（）（尸），（），（），（），（），（）（），：；血管性痴呆（）是指由缺血或出血性脑血管病导致的局部脑缺血缺氧的严重认知功 能障碍综合征，症状除智能、记忆、认知能力受损外，还可伴有语言、执行能力、视空间及人格障碍。占所有痴呆病例的 ，是仅次于阿尔 茨海默病的第二痴呆类型。目前为止治疗主要以胆碱酯酶抑制剂、受体拮抗剂等缓解症状，能短 暂 改善轻中度患者症状，而重度患者收效甚微，且具有一定不良反应。因此，深入研宄的发病机制，探索的新疗法尤为迫切。加减薯蓣丸由金匮要略中薯 蓣丸化裁而来，有健脾补肾、化痰祛瘀、开窍益智之功，临床被广泛应用于痴呆症的治疗，能显著改善患者简易智 能精神状态量表和痴呆证候分型量表评分。同时，该方可显著 改善慢性脑低灌注大鼠的学习记忆能力，保护受损 神经元并促进少突胶质细胞的增生，但其具体机制仍不明晰。目前在中药保护髓鞘受损方面的研宄不多，本研究通过观察加减薯蓣丸对大鼠海马区髓鞘结构及、表达的影响，探讨其潜在 分子机制，同时为中医药治疗提供新的思路。材料与方法实验动物只健康级雄性月龄大鼠，体质量（），由湖北省中医 院动物房提供，动物使用许可证号：（鄂），湖 北省中医 院伦理委员会批准号（伦理批件编号：）。药物、主要试剂与仪器加 减薯蓣丸（，）方剂组成：山药，何首乌，党参，石菖蒲，茯苓，枸杞，当归，杜仲，白术，白芍，川芎，熟地，五味子，远志。将其熬煮过滤、提纯浓缩而成，生药浓度，为湖 北省中医 院 院内制剂（批准文 号：鄂药制字），由湖北省中医院中药房提供。活性氧（）测定试剂盒（南京建成，批号：），超氧化物歧化酶（）测试试剂盒（北京，批号：），（上海，批号：），（美国，批号：），（江苏，批号：），兔多抗（，批号：），兔多抗（，批号：），兔多抗，批号：）。高速冷冻离心机（湖南可成仪器），多功 能酶标仪（），轮转式病理切片机（德国），生物显微镜（尼康），垂直电泳槽（北京六一），智 能数显磁力加 热搅拌器（杭州米欧），化学发光成像系统（杭州申花科技）。动物分组及造模大鼠适应性喂养后随机分为假手术组，模型组，高、中、低 剂量组，每组只。除假手术组外的各组采用改良双侧颈动脉结 扎 改良法制备模型，假手术组不结扎 离 断血管，其余步骤同各组一致。根据前期给药剂量相关研宄，按成人临床推荐剂量与人鼠换算公式，即大鼠给药剂量人给药剂量换算系数（？）？（？），以此作为大鼠灌胃高剂量为（），并设定中药中、低剂量组的灌胃剂量分别为、（？）。术后第天进行水迷宫定位巡航训练，记录每只大鼠的逃避潜伏期，以假手术组大鼠逃避潜伏期的均值为参考值，计算造模大鼠的平均逃避潜伏期与参考值之差占该鼠的平均逃避潜伏期？湖北中医药大学学报 年月第卷第期，时间的比值，比值则认为造模成 功？。水迷宫结束后开始给药，连续，模型组与假手术组灌胃等体积生理盐水。指标检测行为学检测：采用新物体识别试验检测大鼠物体识别记忆能 力。灌胃后，将大鼠放入边长空 箱中适应；第天在箱中放入两个边长的正方体和，大鼠自由探索；第天替换为 高、底面直径的圆柱体，记录大鼠内探索、时间与，每次实验结束后用酒精擦拭物体和箱内面。新物体识别 指数（，）（）。染色观察海马区结构：各组大鼠完成行为学检测后，断头取脑，对大鼠海马组织进行固定、脱水、透明、包埋、切片，以苏木素染色、伊红染色，再次脱水，中性树胶封片，观察海马区组织形态。生化检测观察海马区、表达：大鼠海马组织经生理盐水冲洗、剪碎，加入适量酶消化液后恒温水浴，用终止消化，过滤收集细胞，离心取上清，其后严格 按照试剂盒说明进行。固蓝染色检测海马区髓鞘 结 构：取海马组织用乙醇梯度脱水，石蜡浸蜡，包埋、切片后于髓鞘染液中加盖恒温浸染，冷却后自来水清洗，分化，水洗，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。免疫荧光检测海马区、与表达：取海马组织用乙醇梯度脱水，经透明、包埋、切片、脱蜡后，羊血清室温封闭，加一抗孵育过夜，冲洗，加荧光二抗室温孵育，经冲洗后滴加避光孵育，冲洗后封片，荧光显微镜观察采集图像。免疫蛋白印迹法检测海马、蛋白表达：取适量大鼠海马组织加入裂解液，超声破碎，离心后取上清，法测 定 蛋白浓度。上样、电泳后切胶、转膜、封闭，加入一抗（：）孵育过夜，洗涤后加入二抗（：）恒温孵育，洗涤后显影，分析目标条带。统计学方法采用 软件进行统计分析，连续型变量采用均数标准差表示，数据进行正态性检验及方差齐性检验，根据数据特点，组间 比较用采用单因素方差分析，均数多重比较采用最小显著性差异法（）检验，以为差 异有统计学意义。结果各组大鼠学习记忆的比较与假手术组相比，模型大鼠新物体识别 指数明显下降（），提示造模后大鼠记忆能力明显减退；与模型组大鼠相比，给予治疗后，高、中剂量组大鼠新物体识别指数明显升 高（），低剂量组指数较模型组升高，但差异无统计学意义（）。见表。表各组大鼠新物体识别指 数的 比较）组别新物体识别 指数（）假手术组模型组”加减薯蓣丸高剂量组 加减薯蓣丸中剂量组加减薯蓣丸低剂量组 与假手术组比较，；与模型组比较，。各组大鼠海马区神经元结构的比较假手术组海马区神经元排列紧密，胞质饱满，染色适中，胞体轮廓 清晰，细胞 核多呈圆形，染色较浅。模型组海马神经元间隙增大，细胞排列紊乱，胞质 与胞核染色加深，胞核 形状不均。给予干预后，海马区神经元损伤程度较模型组明显减 轻，细胞排列更为紧密，胞质染色减淡，细胞核 肿胀减轻。见图。假手术组模型组高剂量组中剂量组低剂量组图各组大鼠海马区神经 元结构的染色图（）各组大鼠海马区、含量的比较与假手术组相比，模型组大鼠、水平显著升高（），水平明显降低（）；与模型组相比，组的、水平显著降低，高、中剂量组最为明显（）；高剂量组水平较模型组明显升高（），中、低剂量组水平虽较模型组升 高，但差异无统计学意义（）。见表。年月第卷第期，湖北中医药大学学报表各组大鼠海马区、表达的比较（元，）组别相对荧光强度（）（）假手术组 模型组 加减薯蓣丸高剂量组 加减薯蓣丸中剂量组 加减薯蓣丸低剂量组 与假手术组比较，；与模型组比较，。各组大鼠海马区髓鞘结构的比较较多空泡样改变（如图箭头所示）；与模型组相比，给假手术组大鼠海马髓鞘均匀蓝染，提示髓鞘结构予干预后，大鼠海马区髓鞘 染色加深，提示完整，且细胞排列紧密，空泡较少；模型组大鼠髓鞘 染髓鞘损伤程度减轻，同时空泡样改变减少。见图。色减淡，提示髓鞘完整度降低，且细胞结构 松散，出现假手术组模型组高剂量组中剂量组低剂量组图各组大鼠海马区髓鞘结构的 固蓝染色图（）各组大鼠海马区、与的比较与假手术组相比，模型组大鼠海马区细胞排列较为松散，少 突谱系细胞标记物 荧光强度明显降低，星形胶质细胞标记物与半通道蛋白荧假手术组模型组髙剂量组中剂量组低剂量组图各组大鼠海马区荧光表达的 比较（免疫荧光，）光强度显著增 强。经干预后，大鼠海马区细胞排列较为改善，各组荧光强度均不同程度增 强，同时与荧光 强度明显降低。见图？图。假手术组模型组髙剂 量组中剂量组低剂 量组图加减薯蓣丸对大鼠海马区、荧光表达的影（标记细胞核，呈蓝色；标记少突谱系细胞，呈红色；依次选取响（免疫荧光，）锥体细胞层（中）与其外（下）的共标细胞放大后用箭头标出，提示分化发（标记星形胶质细胞，呈红呈绿色；依 次选取锥体细胞层育 中 的少突谱系细胞）（中）与其外（下）的共标细胞放大后用箭头标出，提示星形胶质细胞）各组大鼠海马区、蛋白表达的比较与假 手术组相比，模型组大鼠海马区、蛋白表达显著升高，蛋白表达显著降低（）。与模型组相比，给予干预后，大鼠、蛋白表达明显降低，），蛋白表达显著 升 高（）；其中中、低剂量组蛋白表达虽有下降，但差异无统计学意义）。见图和表。讨论中医认为发病本在肾精不足，痰瘀互结 为重要病理因素，属本虚标实之证。加减薯 蕷 丸以熟地、何首乌益肾填精，以杜仲、五味子、枸杞子、山药肝脾肾三脏同补，以白术、茯苓、党 参健脾化痰，以川芎、当归、白？湖北中医药大学学报 年月第卷第期，芍活血养血，以远志、石菖蒲开窍醒神，全方共奏补肾健脾、化痰祛瘀之功。现代药理学研宄表明，加减薯？图各组大鼠海马区、蛋白电泳图表加减薯蓣丸对大鼠海马区、蛋白相对表达水平影响 比较（元，）组别假手术组 模型组加减薯蓣丸高剂 量组 士士 士加减薯蓣丸中剂 量组土士士加减薯蓣丸低剂量组与假手术组比较，户；与模型组比较，狀，。蓣丸中的熟地黄？、川弯、石菖蒲等多味中药的单体成 分 具有改善脑缺血诱导的神经元损伤、缓解动物模型认知 障碍的作用。中枢神经系统中，髓鞘 为神经元提供代谢支持，且可发生自适应变化而具有可塑性。星 形胶质细胞通过缝隙连接与少突胶质细胞、髓鞘、神经元进行信息交流，参与从少突胶质前体细胞到髓鞘形成的全程与髓鞘重塑过程。生理状态下，星形胶质细胞通过其表面高表达的半通道蛋白与外 界进行等小分子物质交换与信息传递，同时胞外稳态依赖谷氨酸转运体的调节。慢性脑缺血缺氧状态下，释放増加，促进氧化应激通路，加重组织细胞损伤，炎性环境中星形胶质细胞过度激活，使大量外排，代偿性增 加，积累 的激活少突胶质细胞表面的离子型谷氨酸受体，引起内流，诱导少突胶质细胞凋亡，损 伤髓鞘与学习记忆能力。本研宄也证实，给予干预后，分泌增 加而降低，提示氧 化 应 激通路被抑制；星 形胶质细胞表达降低，伴随与明显降低，提示星形胶质细胞的炎性分泌得到抑制；标记的少突谱系细胞增多，髓鞘磷脂表达更为丰富，提示由少突前体细胞分化为少突胶质细胞的数量增多，且髓鞘损伤得到 改善；同时神经元 结构改善，提示加 减 薯 蕷丸可能通过减轻氧化应激反应缓解星形胶质细胞损伤，抑制的表达，降低水平，从而促进少突谱系细胞的分化与成熟，减轻髓鞘损伤，改善学习记忆能力。此外，有研宄证实表达水平随脑缺血持续时间而