马铃薯块茎中多酚氧化酶互作蛋白的筛选_隋旭.pdf

8 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY生物工程2023年 第48卷 第04期收稿日期：2022-11-09 *通信作者 基金项目：山东省泰山产业领军人才项目(LJNY201702)；2020年山东省博士后创新项目(202003038)。作者简介：隋旭(1997)，男，山东泰安人，硕士研究生，研究方向为农产品加工及贮藏工程。隋 旭，张 耸*，王庆国*(山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018)摘要：多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)是导致马铃薯酶促褐变的关键酶，探究马铃薯酶促褐变过程中与PPO存在互作的蛋白质至关重要。通过采取构建StPOT32原核表达载体，利用His标签纯化树脂进行纯化并获得纯度较高的StPOT32蛋白的方法，以纯化得到的马铃薯StPOT32为抗原制备了抗体，然后通过免疫沉淀-质谱联用技术分析了可能与PPO存在相互作用的蛋白质。质谱结果表明，大量蛋白被StPOT32抗体富集，共富集到2种蛋白酶、60种蛋白酶抑制子、18种氧化应激蛋白、28种防御蛋白作为与PPO互作的候选蛋白。这些候选蛋白中包括已被证明可以影响PPO活性的蛋白，以及与PPO存在相似生理功能的蛋白。该文章初步探究与PPO可能存在互相作用的蛋白，为阐明PPO活性的调节机制提供一定的理论基础。关键词：多酚氧化酶；互作蛋白；免疫沉淀-质谱联用；酶促褐变中图分类号：TS 201.2 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2023)04-0008-09Screening of Polyphenol Oxidase Interacting Proteins in Potato TuberSUI Xu,ZHANG Song*,WANG Qingguo*(College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Tai an 271018,China)Abstract:Polyphenol oxidase(PPO)is the key enzyme responsible for enzymatic browning of potato.For investigating the proteins that interacted with PPO during enzymatic browning of potato,the StPOT32 prokaryotic expression vector was constructed.Then StPOT32 was purified using His-tag resin.Anti-StPOT32 was prepared using prokaryotic expression of StPOT32,and then proteins that may interact with PPO were analysed by immunoprecipitation-mass spectrometry.The mass spectrometry results showed that a large number of proteins were enriched by the StPOT32 antibody.2 proteases,60 protease inhibitors,18 oxidative stress proteins,and 28 defence proteins were enriched as candidate proteins for interaction with PPO.These candidates include proteins that have been shown to affect PPO activity and proteins that have similar physiological functions to PPO.This study is a preliminary investigation of the proteins that may interact with PPO and to provide some theoretical basis for the elucidation of the regulatory mechanism of PPO activity.Key words:polyphenol oxidase;interacting protein;immunoprecipitation-mass spectrometry;enzymatic browning马铃薯块茎中多酚氧化酶互作蛋白的筛选DOI:10.13684/ki.spkj.2023.04.034 9 生物工程食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2023年 第48卷 第04期0 引言马铃薯是世界上第四大粮食作物，仅次于小麦、水稻和玉米。在过去的20年里，它的产量稳定在世界主要商品农作物产量的4%5%。根据FAO的数据，2019年中国和印度的马铃薯产量占世界总产量的38%以上。为了促进粮食安全，中国推行了“马铃薯主粮化”战略1，这需要开发更多的马铃薯初级加工品，丰富马铃薯产品的种类，然而酶促褐变对马铃薯的初级加工提出了挑战2。酶促褐变是水果和蔬菜中常见的品质劣变现象，主要由损伤、衰老和胁迫导致3。酶促褐变过程中，关键酶PPO将植物体内的单酚羟基化为二酚，而后将二酚氧化为醌；醌经历一系列聚合、缩合反应形成黑色素，沉积于伤口表面4。PPO是一种定位于质体的含铜酶，目前在马铃薯中发现了9个编码PPO的基因，并表达于马铃薯生长的各个时期5。马铃薯块茎中的PPO主要由StPOT32和StPOTP1/P2基因编码，其中StPOT32蛋白存在于马铃薯块茎发育的全过程和块茎的各个部位，对马铃薯块茎PPO活性的贡献最大5。PPO蛋白包含3个结构域，分别为N末端、中心结构域和C末端。其中N末端含有质体信号肽，PPO蛋白转运到质体中后，其N末端会被切割掉，此时只含有中心结构域和C末端的PPO蛋白被称为PPO酶原；中心结构域含有2个铜离子(CuA和CuB)且每个铜离子由3个组氨酸配位，铜离子的价态和桥接方式对于PPO的催化活性至关重要，该结构域负责结合底物，是PPO活性的贡献者；C末端的主要作用是，占据底物与活性中心的结合位点，屏蔽PPO活性6。因此，当C末端被水解或远离活性中心时，PPO酶原活化为具有活性的PPO，引起PPO酶活迅速升高7。采后加工时的切割过程中，外界条件可能会导致质体中的PPO酶原被激活，进而引起酶促褐变。马铃薯块茎中存在大量的可溶性蛋白8。已有报道表明，这些可溶性蛋白中的蛋白酶抑制子可能具有调节酶促褐变的功能9。DONG T T等10过表达天冬氨酸蛋白酶抑制子，能够使马铃薯块茎中的PPO活性降低，进而抑制鲜切马铃薯褐变，这表明蛋白酶抑制子可能是通过抑制PPO酶原活化来降低PPO活性的。另外，虾中的PPO酶原级联激活过程已经被阐明，细胞膜结构的破坏与自由水分子流动性增加，共同造成丝氨酸蛋白酶、Ca2+和PPO丧失空间隔离并聚集，这导致了PPO酶原的异常激活和褐变的启动，因此说明蛋白酶能够激活PPO酶原11。DERARDJA A E等12报道了利用低浓度的外源植物蛋白酶制剂，在几分钟内即可激活杏的PPO酶原，造成PPO活性升高，这种激活方式可能依赖于蛋白酶对C末端的水解。因此，植物PPO的活性可能会受到内源蛋白质的影响，然而目前关于直接调控PPO活性的蛋白尚不明确。本研究通过体外原核诱导、纯化马铃薯PPO蛋白，并免疫兔子制作其抗体，而后利用免疫沉淀-质谱联用(Immunoprecipitation-Mass Spectrometry，IP-MS)技术，鉴定可能与PPO存在相互作用的内源蛋白，为调控马铃薯PPO活性提供一定的理论依据，促进发展新型、高效的抑制鲜切马铃薯褐变技术。1 材料与方法1.1 主要材料与试剂1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌蛋白表达质粒pET-32a(+)：山东农业大学食品科学与工程学院采后实验室保存；大肠杆菌感受态细胞：克隆宿主菌株DH5，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；表达宿主菌株BL21(DE3)：上海昂羽生物技术有限公司。1.1.2 生物材料和主要试剂 马铃薯品种：荷兰15，山东省济南市莱芜区，购入后于4 冷库保存；全能型植物RNA提取试剂盒、反转录试剂盒：康为试剂生物科技有限公司；胶回收试剂盒、同源重组试剂盒、Taq DNA聚合酶预混液、质粒DNA小提试剂盒：南京诺唯赞生物科技股份有限公司；羧苄青霉素、脱脂乳粉、异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、尿素、PVDF膜：索莱宝生物科技有限公司；DNA聚合酶预混液：湖南艾科瑞生物工程有限公司；His标签纯化树脂：上海碧云天生物技术有限公司；NaCl、NaH2PO3、Na2HPO3：分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物：英国OXOID公司；山羊抗兔二抗(HRP标记)：亚科因(武汉)生物技术有限公司；10%SDS-PAGE凝胶试剂盒、高敏ECL化学发光试剂盒、5还原型蛋白上样缓冲液、标准蛋白分子质量标记：苏州新赛美生物科技有限公司；标准蛋白分子质量标记：上海雅酶生物医药科技有限公司；IP/Co-IP试 10 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY生物工程2023年 第48卷 第04期剂盒：上海翎因生物科技有限公司；DNA分子质量标记：北京睿博兴科生物技术有限公司。1.1.3 缓冲液和培养基 LB(琼脂)培养基：胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 1 g，(琼脂1 g)，用去离子水定容至100 mL。蛋白纯化平衡缓冲液(平衡液)：6.06 g Tris，29.22 g NaCl，480.48 g(8 mol/L)尿素，溶于去离子水后用浓盐酸调节pH值至7.5，定容至1 L。透析液：平衡液，尿素浓度分别降至6、4、2、0 mol/L。磷酸缓冲液(pH6.8)：1.75 g Na2HPO3，0.8 g NaH2PO3，用去离子水定容至100 mL。1.2 主要仪器与设备YJ-VS-1单人垂直超净工作台：无锡一净净化设备有限公司；PowerPac Universal通用电泳仪、T100PCR仪、GelDoc XR+凝胶成像系统、1658001小型垂直电泳槽：美国伯乐公司；Bio-Photometer D30蛋白核酸测定仪、各种型号移液器：德国艾本德股份公司；SCIENTZ-D超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；IKA A11 basic液氮研磨仪：德国IKA集团公司；DHG-9240A电热鼓风干燥箱、HZQ-X300C恒温振荡器：上海一恒科学仪器有限公司；TS-1脱色摇床：海门市麒麟医用仪器厂；WD-9406胶片观察灯：北京六一生物科技有限公司；Amicon Ultra 30K device超滤离心管：德国默克密理博公司。1.3 PPO蛋白获取与抗体制备1.3.1 PPO基因的克隆 利用NCBI BLAST(http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov)对StPOT32(Q41427，Uniprot)的基因序列进行分析，并设计StPOT32基因特异性引物。使用全能型植物RNA提取试剂盒提取马铃薯块茎总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA。而后以该cDNA为模板扩增StPOT32基因，扩增使用的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。上游引物为5-GCCATGGCTGATATCGGATCCATGGCAAGCTTGTGCAATAGTAGT-3，下游引物为5-TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTAACAATCTGCAAGACTGATCGTC-3。PCR扩增体系为20 L：DNA聚合酶预混液10 L，cD