鸡传染性鼻炎诊断技术 NYT 538-2002.pdf

NY/T538-20023.2.2PCR临床样品的预处理将浸过棉拭子的离心管以8000r/min10000r/min离心10min,小心吸去大部分上清液，保留20L左右液体（若原始样品中混有血液，可2000r/min离心3min5min,使血球沉于管底，将上清液转到新管里，再高速离心)。经上述处理过的样品，可开始消化，或在一20保存。3.2.3PCR临床样品消化用吸头将离心管中沉淀物与剩余液体混合均匀，从中取1L置于含9LPCR消化液的0.5L小离心管中（注意：做不同样品时应换吸头），然后压紧离心管盖，56水浴1h,然后9510min,再冰浴10min后进行PCR扩增或置一20保存。3.2.4PCR菌落样品制备挑取平皿上的可疑菌落，加到含10L蒸馏水的0.5mL的小离心管中，压紧管盖，95加热10min,再冰浴10min后进行PCR扩增或-20保存。3.2.5PCR阴阳性对照样品制备用10L消化液作为阴性对照样品，用9L消化液加1L已知阳性对照物作为阳性对照样品。56水浴1h,然后9510min,再冰浴10min后进行PCR扩增或置-20C保存.3.2.6PCR扩增将样品管舜时离心，使附着于管顶、壁上的液滴沉下，然后加入15LPR反应液，使总体积为25L。再瞬时离心，然后加入50L矿物油覆盖，置PCR仪上进行扩增反应。程序为941mn、651min、722min循环25次，941min、651min、7210min循环一次。3.2.7琼脂糖凝胶电泳按照附录D制备0.7%的琼脂糖凝胶，从各PCR反应管中分别取10L反应产物与2L加样缓冲液混合均匀，然后加入到样品孔中。初次操作时应设置DNA分子量对照，60V80V稳压电泳30min50min,至加样缓冲液的染料带走出2cm3cm时停止电泳。3.2.8结果在紫外检测仪下观察结果，必要时可拍照保存。3.3结果判定与表示方法阳性对照样品应呈现一条0.5kb的DNA带，阴性对照样品不应有这条带，被检样品若出现与阳性对照同样大小的一条DNA带，则判为阳性，记作“+”，若无此带，则判为阴性，记为“一”。阴、阳性对照应分别出现阴、阳性结果，否则，全部样品应该重做。4血清平板凝集试验4.1材料准备4.1.1鸡传染性鼻炎平板凝集试验抗原、阴、阳性对照血清，按说明书保存和使用，使用前与被检血清一起恢复至室温。4,1,2试验用玻板（也可用载玻片）、可调微量加样器1个、灭菌吸头若干，记号笔。4.2操作程序4.2.1本试验在室温(2025)进行。4,2.2先在玻板背面写好编号，每个样品间至少留20mm空隙，再在每个序号边加抗原15L。4,2.3按玻板上的序号加对照或被检血清15L,每个血清样品换一个吸头，将血清与抗原混匀，反应持续3min5min,在此时间内观察结果。每次试验均设阴、阳性对照。4,2.4在黑色背景或在灯下明亮处观察并记录结果。4.3结果判定与表示方法判定标准见表1。2