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不同类型细胞的培养特点.pptx
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不同类型 细胞 培养 特点
第六章 个别细胞和组织的培养,第一页,共七十页。,类型:正常细胞培养肿瘤细胞培养,第二页,共七十页。,第一节 正常细胞培养,正常细胞,在体外培养时都不易生长,建立细胞系更难。正常细胞难培养的原因是它们是分化的细胞,对体外生存条件要求严格.但只要一切条件适当仍有培养成功可能。,第三页,共七十页。,一、上皮细胞类培养,上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层;培养中只有源于外和内胚层的细胞能反映出上皮细胞的特征,细胞呈膜状生长的特点。,第四页,共七十页。,上皮细胞培养有三个难点:需求特殊底物,如在底物上涂有胶原底层那么利于细胞生长;需求特殊培养基;与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞同时混杂生长,并常压过上皮细胞。纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养的关键之一。,第五页,共七十页。,(一)表皮细胞培养1特点:在有胶原的底物上易生长;把人或小鼠表皮细胞培养在以3T3 细胞为饲养层(用射线照射后)上时,细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低pH、Ca2+的含量和温度等,均利于表皮细胞生长。向培养基中加氢化可的松(10 g/m1)、10-6M的异丙基肾上腺素(Isoproterenol)和10 ng/m1 促表皮生长因子(EGF)能促表皮细胞生长。,第六页,共七十页。,【饲细胞】饲细胞(Feeder Cells)也称滋养细胞,是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。饲细胞作用:有同化营养液的能力。饲细胞能促克隆细胞的生长,利于克隆的形成。克隆形成后饲细胞渐死亡,换液时去除。,第七页,共七十页。,饲细胞的制备:(1)取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞,90%集合时制成细胞悬液,再按103 细胞/毫升重新接种培养;(2)在细胞半集合时,准备0.25g/ml 的丝裂霉素,按2ug/105 细胞的量参加到培养瓶中过夜;或用射线单次照射,剂量3050 戈瑞(Gy);(3)细胞经上述处理后,Hanks 液漂洗两次、更换培养液、再培养24 小时,胰蛋白酶消化细胞制成悬液,按5104/ml接种入新培养基中;(4)48 小时后,即可用于细胞克隆之用。,第八页,共七十页。,2表皮细胞培养程序:(1)取材:取外科植皮或手术剩余皮肤小块,以角化层薄者为佳,早产流产儿皮肤更好,切成0.5 1cm2小块;(2)EDTA 处理:先置入0.02 EDTA 中室温置5 分钟。(3)冷消化:换入0.25%胰蛋白酶中,置4过夜;(4)别离:取出皮块,用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开;,第九页,共七十页。,(5)温消化:取出表皮单独处理;用剪刀剪成更小的块后,置入新的0.25胰蛋白酶中,37再消化30 60 分钟;(6)制细胞悬液:用吸管轻轻反复吹打,使成细胞悬液;(7)加培养液:通过80 目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸上清,直接参加Eagle 液和20小牛血清.(8)培养:接种入碟皿中,CO2 温箱培养。,第十页,共七十页。,本卷须知:冷消化目的在于使表皮和真皮结合松散;如冷消化后别离下来的表皮膜自身也已松散,此时亦可直接置入PBS 中用吸管吹打制备细胞悬液;不再经过第二次消化。,第十一页,共七十页。,(二)胃上皮细胞培养,适于胃上皮细胞生长的条件是:胶原酶和透明质酸酶消化法并用消化细胞;应用胶原底物培养;制备含有特定成分的培养基;,第十二页,共七十页。,培养程序:(1)取材:取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许;(2)清洗:用含庆大霉素(400g/m1)和两性霉素(2g/m1 的Hanks)液漂洗后,用钝器剥离下粘膜,剪成1mm大小;(3)消化:在I 型胶原酶和透明质酸酶中,于37中消化80 分钟;(4)离心:收集细胞悬液,800 转/别离心后,Hanks 液漂洗两次;,第十三页,共七十页。,(5)接种:末次离心后参加含有1 2胎牛血清的完全培养基,接种入不同孔数的培养板中;接种量依不同实验目的而定。细胞接种后一般在16 小时内贴壁,细胞呈多角形,成岛状或片状生长,以后逐渐联接成片。初代培养可维持2 3 周,第一周末达顶峰,最后逐渐衰退剥落。,第十四页,共七十页。,(三)肝细胞培养,肝脏具有取材方便和易于生长的优点,能获得典型上皮细胞培养。1初代组织块培养:肝组织做组织块培养效果很好。取新鲜肝脏,先剥除被膜和血管等纤维成分,用刀或剪刀把肝剪成1mm3 左右的小块,采用贴壁培养法。肝组织易于贴壁,生长力好,一般次日即可出现生长晕。,第十五页,共七十页。,2初代消化法培养:(1)把肝组织切成2 4 立方毫米的小块,用不合钙镁的BSS 液洗两次;(2)移入1:1 的0.1胰蛋白酶和0.1胶原酶(都用无钙镁BSS 配制)中,4冷消化10 12 小时后,通过250 微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过(用纱布滤过亦可);(3)收集细胞、BSS 液洗1 2 次、计数、接种培养;,第十六页,共七十页。,3肝脏灌流法:需用全肝,以较小动物如小鼠和大鼠为好。(1)无菌解剖动物,取出肝脏,先用BSS 洗除血污;(2)取5ml 注射器一支,吸取消化液后,把注射器头轻轻插入肝管中,用线绳结扎牢固,以防消化液漏出,轻轻把消化液注入胆管系统,并不时轻柔压肝脏,以便消化液进入肝小叶中;消化液在肝内停留20 30 分后,在吸出消化液的同时并轻柔压肝脏,以使肝细胞脱落和消化液吸出;,第十七页,共七十页。,(3)待吸净消化液后,注入离心管中,低速离心别离,用RPMI 1640 培养基培养(较其它培养基为好),能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。,第十八页,共七十页。,(四)内皮细胞培养,应用材料:人脐带脐静脉、动物大动脉等,用灌流消化法获取细胞最为简便。,第十九页,共七十页。,(1)取产后的新鲜脐带;如不立即培养可保存于4中,但不宜超过12 小时;无菌剪取长10 15 厘米一段。其它如胚胎和幼体动物的大血管,亦可用于培养;(2)先用三通注射器吸温PBS 液注入脐带的脐静脉中,洗除残血;注入口处宜用线绳结扎,以防液体返流;,第二十页,共七十页。,(3)用血管钳夹紧脐带一端,从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1的胶原酶,待末端出现液体后结扎之,令充满血管,注入口亦应结扎,以防液体返流,消化3 10 分钟;(4)吸出含有内皮细胞的消化液,注入离心管中;为获取更多细胞,可再注入温PBS 冲洗2 3 次彻底去除干净剩余细胞,一并注入离心管中离心;(5)吸除上清,加1640 培养液,制成细胞悬液,接种入瓶皿中培养,顺利时2 3 天内细胞即可长成单层。,第二十一页,共七十页。,第二十二页,共七十页。,人脐带易于获得,培养效果好;细胞生长后,一般传6 7 代后即衰退,难以长期维持。用兔血管内皮细胞培养较好,可传10 30 代;不同部位血管内皮细胞生物学性状不同,对各种作用因素反响亦有很大差异。,第二十三页,共七十页。,(五)毛细血管内皮细胞培养,毛细血管细小,结构简单,内皮细胞外有较多的结缔组织,进行别离培养有很大困难。近年毛细血管培养已获成功;利用人的小儿包皮、人脾脏、牛肾上腺、癌组织(如卵巢癌)等均可;,第二十四页,共七十页。,1材料:肿瘤条件培养基制备(1)取C3H 小鼠的S-180 实体肉瘤组织;(2)胰蛋白酶消化,Dulbecco 改进Eagle 氏培养液15m1(含10小牛血清)种到培养瓶中培养;,第二十五页,共七十页。,(3)在细胞生长接近完全集合时,收集培养液制成条件培养基;再用含10小牛血清的新培养液后,也每隔两天收集一次,可获多量条件培养基;(4)4000 转别离心后,再通过0.22m 微孔滤膜滤过,-20冻存备用(临用前融解)。凝胶底层制备(1)取60 mm Falcon 产培养皿,加1%Difco 产明胶(用不合钙和镁的Hanks 液配制),铺盖瓶底,形成薄层;(2)置4过夜;用前再用少许培养液冲洗一次。,第二十六页,共七十页。,2初代培养(1)取材:取新鲜牛肾上腺数个,先用Hanks 液洗除血污;(2)消化:剥除被膜,别离出皮质,切成l mm3 小块,加0.5胶原酶室温中消化1 小时;每隔10 分钟用吸管吹打悬液令消化充分;(3)过滤:通过不锈钢纱网滤过,网眼要求只允许能通过小于110 微米长的毛细血管小段;(4)离心:650 rpm,4,离心7 分钟后,弃掉上清胶原酶;,第二十七页,共七十页。,(5)再离心:沉淀物用培养液重悬并离心,再重悬,再离心,共两次;(6)制细胞悬液:末次沉淀物仍用含10小牛血清的Dulbecco 改进Eag1e 氏培养液重悬后,稍吹打;(7)接种:接种入铺有明胶底层的培养皿中,37培养;在培养头1 3 小时中,毛细血管小段和内皮细胞最先贴附于底物上,而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮;(8)换液:吸除培养液,再参加肿瘤条件培养液;每两天换液一次。毛细血管小段一般成自1 4 个内皮细胞,以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛,能持续2 5 天。,第二十八页,共七十页。,3毛细血管内皮细胞别离培养:(1)初代培养2 3 天后,镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛,在培养皿反面,用不脱色笔划圈圈起;(2)镜下检查,如圈内残有非内皮细胞时,可用显微细针在倒置显微镜下挑除;用细胞解剖器也可,宜在净化台无菌气流中、翻开培养皿盖进行,但时间不宜过长(15 20 分钟);圈外非内皮细胞可用无菌胶刮刮除;,第二十九页,共七十页。,(3)用培养液漂洗两次,以去除漂浮细胞;(4)剩余内皮细胞岛如小(5 20 个细胞)而少时,生长增殖常变得缓慢或完全不生长,此时需参加3T3等饲细胞;饲细胞接种量为4000 细胞cm2;(5)当内皮细胞充满所有饲细胞空间后,用胰蛋白酶消化、离心、参加肿瘤条件培养基;(6)接种入明胶底物皿中继续培养(饲细胞死亡被淘汰),细胞增殖生长集合后,按1:5 传代。,第三十页,共七十页。,第三十一页,共七十页。,二、结缔组织类细胞培养,(一)成纤维细胞培养包括人在内的各种成纤维细胞都很容易培养,也是其它组织培养时的副产物,极易获得。用人或动物胚体为好;动物可用小鼠或鸡胚,去头和内脏,剪成小碎块后,用胰蛋白酶消化法培养;如为人胚,可取皮肤培养。幼儿包皮是培养成纤维细胞的很好对象。,第三十二页,共七十页。,小鼠成纤维细胞培养条件,12.514.5d胎龄的小鼠胎儿别离效果最好;最佳答案培养基为DMEM添加15%小牛血清;第3代细胞增殖最旺盛;室温条件下,0.125%胰蛋白酶消化时间以810min为宜。在培养ES细胞时,应选择第35代的小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞。,第三十三页,共七十页。,小鼠成纤维细胞;细胞来源:swiss小鼠胚胎,第三十四页,共七十页。,第三十五页,共七十页。,(二)巨噬细胞培养巨噬细胞属免疫细胞,有多种功能,是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得,便于培养,并可进行纯化。但属不繁殖型细胞群,难以长期生存,好的条件下仅能生活2 3周,因之多用作初代培养。巨噬细胞也能建成无限细胞系;大多来自小鼠,如P388D-1、J774A1、RAW309、Cr.1 等。,第三十六页,共七十页。,1培养技术要点:来源和取材 巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。实验多从动物血液、肺、脾和胸腹腔获取,其中以从动物腹腔取材最常用。用40g 的PHA 注入腹腔中,能产生6 8106 个细胞,而且无刺激性,效果较好。,第三十七页,共七十页。,2培养方法:培养巨噬细胞可用各种方法和各种来源获取细胞,其中以小鼠腹腔取材法最为实用。人的材料除来源不同外,培养方法大同小异。程序(1)实验前三天,向每只小鼠腹腔内注入无菌硫基乙酸肉汤1ml(勿注入肠内);(2)引颈杀死动物;手提鼠尾将全鼠浸入70酒精中3 5 秒;(3)置动物于解剖台上,用针头固定四肢,双手持镊撕开皮肤拉向两侧,暴露出腹膜,但勿伤及腹膜壁;(4)再用70酒精擦洗腹膜壁后,用注射器吸10ml Eag1e 液注入腹腔中,同时从两侧用手指揉压腹膜壁,令液体在腹腔内充分流动;,第三十八页,共七十页。,(5)用针头轻轻挑起腹壁

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