实验三新生大鼠大脑皮层混合细胞的培养和鉴定第一页，共十三页。一、实验目的通过混合培养传代的方法纯化能得到星形胶质细胞，同时对其进行形态学的观察和相关的免疫抗原反响鉴定，旨在建立比较成熟的细胞培养系统，为后续实验中提供稳定的细胞来源。第二页，共十三页。二、实验材料、试剂与器材1H-DMEM培养基；胎牛血清；小牛血清；N2Supplement；多聚赖氨酸、Hoechst33258、BrdU；羊抗鼠GFAP抗体、羊抗鼠BrdU抗体；FITC标记羊抗鼠二抗、PE标记的羊抗鼠二抗；FITC标记的羊抗鼠β-III-Tubulin抗体。2超净工作台；二氧化碳培养箱；低速台式离心机；活细胞工作站；倒置相差显微镜及照相系统；倒置荧光显微镜及照相系统；电热恒温鼓风枯燥箱；电热恒温水槽；超声波清洗机；立式压力蒸汽灭菌器。第三页，共十三页。三、实验原理混合细胞培养时主要取材于SD大鼠大脑皮层，体外剥离脑膜后机械吹打分散成单细胞悬液接种在血清培养基中，因为原代培养过程是将体内环境转变成体外环境，只有一小局部细胞成活下来，随着培养时间的延长，细胞开始成熟、分裂。原代培养约一周左右，细胞能长满皿底，细胞生长状态较好。胰酶消化原代培养的混合细胞并重新接种，大局部神经元死亡，在含有血清的培养条件下不断的传代导致细胞种类单一化，即为星形胶质细胞。相对于神经元的培养，神经星形胶质细胞的培养要简单，细胞对环境的变化要求较小。第四页，共十三页。神经胶质酸性蛋白〔GFAP〕是星形胶质细胞特异性胞内抗原，而神经细胞粘附分子〔NCAM〕是神经类细胞〔包括神经胶质细胞、神经元以及神经前体细胞〕外表特异性抗原；微管蛋白〔tubulin〕是组成神经元骨架的重要组成成分和原始神经上皮中所表达的最早的神经元标志物之一，其中III型β微管蛋白〔β-III-tubulin〕作为神经元特有标志物，被广泛应用于神经生物学研究中。本实验利用GFAP、NCAM、β-III-tubulin分别对体外培养的星形胶质细胞和神经元进行特异性抗原染色，鉴定细胞种类及纯度。第五页，共十三页。四、实验步骤取出生48h以内的新生大鼠，75%酒精擦拭消毒后断头处死，剪开头部皮肤，外撕，然后剪破颅骨，用眼科镊沿大脑前方夹断视神经，小心取出大脑放于90mm塑料培养皿预冷的无菌Hank’s液中。在解剖显微镜下用脑科镊分开左右半球，除去脑膜以及上面的血管，并除去大脑前方的嗅球和下方的下丘脑，将剥离脑膜的大脑皮层转入另一含预冷Hank’s液的塑料培养皿中，清洗2-3次。将清洗后的大脑皮层...
