一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011.pptx

1,第一章、植物病原真菌的别离、培养及纯化技术,第一页，共六十五页。,2,1材料：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml,1、马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基,马铃薯葡萄糖琼脂：potato dextrose agar,简称PDA；马铃薯蔗糖琼脂：potato sucrose agar,简称PSA。,一、真菌学研究中常见的培养基的制作和灭菌,第二页，共六十五页。,3,第三页，共六十五页。,4,2制作步骤马铃薯洗净，去皮称200g切块/条，1000ml水煮沸30min，用双层纱布滤去薯块，参加15-20g琼脂，加热熔化，再加20g葡萄糖，待完全溶解后，趁热用双层纱布再过滤，补水并定容到1000ml,分装于三角瓶或试管中，塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。,第四页，共六十五页。,5,自然pH；调pH值，也可用1mol/L的NaOH或HCl调至pH为5.56.5之间，最后加水补足至1000mL。Tips:实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水井水含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好防止使用。,第五页，共六十五页。,6,2、植物组织和煎汁 许多植物材料如豆荚、茎秆、种子等，可以放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即能做培养基使用。植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微生物的营养需要，各种植物的煎汁都可用作培养液，如加琼脂即能制成固体培养基。当然，必须灭菌后才能使用。,第六页，共六十五页。,7,3、培养基的分装根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管或三角瓶中。试管分装时，使用玻璃漏斗。装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的分装量为管高的1/5左右，用三角瓶分装培养基时，容量不宜超过容积的1/3-1/2。注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾湿棉塞而引起污染。,第七页，共六十五页。,8,制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。,4、灭菌,高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。,别离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干/烘干、包装好，进行干热灭菌。,灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。,第八页，共六十五页。,9,滤膜孔径主要有0.22 m和0.45m两种。过滤太快，滤液中将混入细菌而使除菌不完全。,第九页，共六十五页。,10,第十页，共六十五页。,11,5、斜面、平板培养基的制作试管培养基灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条，然后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度的2/5至3/5，冷凝后即成斜面培养基。三角瓶中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板培养基。方法是：将培养基冷却至4550低于45易凝固，应在水浴锅中加热融化，左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部，用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿翻开一小缝，使瓶口正好伸入，倾入培养基约15mL，平置、凝固即成。注意：操作者事先必须洗净手，并用70%酒精消毒。,第十一页，共六十五页。,12,二、真菌别离,植物病原菌的别离培养，是植物病理实验室工作中的根本技能。,第十二页，共六十五页。,13,真菌的别离-就是将所需要的真菌与其它杂菌分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯培养。,一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或参加某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。,第十三页，共六十五页。,14,观察一种真菌病害的标本，不一定都能检查到子实体而 作出诊断。同时，在病部外表或组织中检查到的真菌，有时也不能断定就是它的病原物，也有可能是植物组织死亡后在上面生长的腐生性真菌。因此，对有些病害病原物确实定，最好是经过别离和培养工作，且在适当的环境下进行接种试验，确定它的致病性。此外，为了进一步研究真菌的形态、生活史、生理和生态，或者用于发酵如生产抗菌素等，别离而获得真菌的纯培养物是必要的。,一目的意义,第十四页，共六十五页。,15,别离和培养应该在无菌至少很清洁的条件下进行。,二、真菌别离的程序,1别离前的准备工作,第十五页，共六十五页。,16,1.1 清洁环境：别离工作严格说应在无菌条件下进行，无菌室或无菌箱是别离不可缺少的设施。,为了保证无菌操作，应注意下面几点：,1.2 假设限于条件实验只能在普通房间进行时，必须对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。地上多洒些水，以消除室内尘埃，工作台上铺好湿毛巾，点燃酒精灯。,第十六页，共六十五页。,17,1.3 别离工作开始前最好将所需的一切用品都准备好，放在超净工作台内或伸手可及的台外，以防止操作过程中频繁走动，破坏环境带来杂菌；1.4 保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；1.5 无菌操作前还要用70酒精擦手；1.6 工作中，特别在进行无菌操作时，呼吸要轻，不要说话等。,第十七页，共六十五页。,18,别离材料的选择对别离培养的成败有着决定的影响。病害材料应尽可能新鲜，如可选择新近发病的植株、器官或组织作为别离的材料，可以减少腐生菌的污染。最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活泼，容易别离成功。,2别离材料的选择,第十八页，共六十五页。,19,例如：果实的腐烂病，就应该从刚开始腐烂的局部别离。根腐病和枯萎病也是如此，应该尽可能从病株离土需较远的局部别离。值得注意的是有些有晕圈的斑点病如野火病，病菌局限在斑点中央的坏死组织中，从病斑的边缘是别离不到病菌的。当然，这类病害是比较少的。,从受害的边缘局部别离这一原那么，对于绝大局部病害都是适用的。,第十九页，共六十五页。,20,采得的材料如已经败坏而沾染大量的腐生菌，有时可以采用接种后再别离的方法，即将沾染有腐生菌的病组织作为接种材料，直接接种在健全的植物组织工植株上，等发病后再从病株或病组织别离。先接种再别离的方法，用得较多的是植物病原细菌的别离。,引起果实和蔬菜腐烂病的真菌，如腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)的真菌，用这种方法别离的效果也很好。,别离烟草的根腐病菌(Thielaviopsis)，用这种方法效果也很好，将烟草种子播在培养皿中的吸水纸上，然后用田间采得的烟草病根切成小块，撒在种间，幼苗染病后移到胡萝卜琼脂培养基平板上，病菌即生长而得到纯培养。,第二十页，共六十五页。,21,1酒精 用酒精70%消毒，只浸很短的时间几秒钟到1分钟，然后用灭菌水冲洗；较大的材料往往是在酒精中浸过后，或用棉花塞蘸酒精涂在组织外表，然后都在火焰上将酒精烧去。,3组织的外表消毒剂,第二十一页，共六十五页。,22,配方为：升汞 1g，浓盐酸2.5mL，加水 至1000mL。将升汞溶于浓盐酸中，待其充分溶解后，用水稀释。升汞剧毒、无色，为便于认识，可在溶液中加几滴红染料。消毒时间因材料质地、发病部位深浅及污染情况而异，一般35分钟。消毒后用无菌水冲洗34次。,2升汞溶液0.1%,第二十二页，共六十五页。,23,3次氯酸钠NaClO3 由于漂白粉的成分不固定而影响其消毒效果，目前多改用次氯酸钠.消毒所用的浓度一般是3%-5%的水溶液，消毒时间5-15分钟。幼嫩的病组织，外表用药剂消毒时可能会同时杀死其中的病原真菌，消毒时间应尽量缩短。比较平安的方法是不用药剂消毒，而以灭菌水洗8、9次。,第二十三页，共六十五页。,24,4常规别离方法,植物病原真菌的别离方法主要有两种：组织别离法和稀释别离法。组织别离法是最常用的方法.稀释别离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的别离。,第二十四页，共六十五页。,25,植物病原真菌的别离一般都是用组织别离法。就是切取小块病健组织，经外表消毒和灭菌水洗过以后，移殖在琼脂培养基平板上培养。切取组织的大小要适宜，一般可将较大的组织，在消毒液中消毒后切取中央局部，经灭菌水洗过以后培养。,4.1 组织别离法,第二十五页，共六十五页。,26,1选取典型的病组织，在病健交界处将其剪成5mm5mm的小方块假设干，装于火焰灭菌的小碟中。注:选择新患病的组织作为别离的材料，可以减少腐生菌混入的时机。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的局部滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的局部别离。,植物病原真菌的组织别离的技术与步骤：,第二十六页，共六十五页。,27,2向装有病组织的小碟中参加70%酒精约半碟进行外表消毒，十几秒后倒掉酒精。注:先用70的酒精浸2、3s是为了消除寄主外表的气泡，减少外表张力，70的酒精亦用于外表消毒，处理的时间较短(一般数秒至lmin)。,第二十七页，共六十五页。,28,3向小碟中参加0.1%升汞或10%次氯酸钠溶液约半碟进行外表消毒，处理时间可自30秒至3分钟不等，然后倒掉废液。注：升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，如植物组织柔嫩，那么外表消毒时间宜短；反之那么可长些一般情况下，需时间3、5min。,第二十八页，共六十五页。,29,4向小碟中加灭菌水，冲洗3-4次除去残留的消毒剂，将病组织转移到灭菌滤纸上吸去多余的水以大大减少病组织附近出现细菌污染。,第二十九页，共六十五页。,30,5将吸干水分的病组织移到预先倒好的PDA平板上，注意要用镊子轻压组织使其着靠在培养基上。,第三十页，共六十五页。,31,6每皿5块，均匀摆放，倒置于25培养箱中培养。4-5天后检查结果。写明日期、姓名等。,第三十一页，共六十五页。,32,各种真菌病害发生的部位和病症不同，其别离要根据具体情况，采用不同的方法，下面介绍几种典型材料的别离法。,4.1.1 斑点病病原真菌的别离,4.1.2 维管束组织内病原真菌的别离,4.1.3 根腐病菌的别离,4.1.4 肉质组织中病菌的别离,4.1.5 种子内病菌的别离法,第三十二页，共六十五页。,33,4.1.1 斑点病病原真菌的别离,从病斑切取每边约3-5mm的小块病组织，用70%的酒精浸几秒钟，再在0.1%的酸性升汞水溶液中浸3-5分钟；而后用灭菌水换洗3次，将其移置在琼脂培养基平板上培养。,第三十三页，共六十五页。,34,4.1.2 维管束组织内病原真菌的别离,第三十四页，共六十五页。,35,从根茎维管束组织别离病菌，可先将寄主病部外表用70酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。,第三十五页，共六十五页。,36,4.1.3 根腐病菌的别离 根腐或基腐病菌的别离，由材料的大小决定。材料小的可以仿照斑点病的别离法。材料大的那么可采用维管束组织内病原真菌的别离法。,第三十六页，共六十五页。,37,4.1.4 肉质组织中病菌的别离 多肉的茎、根和果实等，可以采用维管束组织内病菌的别离法，除去外表组织，切到其中小块病组织别离。,如有杂菌感染可采用“直接接种法，待出现病症后，用此法再行别离。,第三十七页，共六十五页。,38,第三十八页，共六十五页。,39,种子如在未破裂的果荚内，可以不经过外表消毒，在无菌的条件下取出移在培养基平板上培养。,4.1.5 种子内病菌的别离法 将整粒的种子或种子的一局部进行外表消毒升汞或漂白粉，用灭菌水洗涤后移在琼脂培养基平板上培养。,第三十九页，共六十五页。,40,稀释法是微生物学上最早使用的别离法，主要用于别离细菌和酵母菌等。,4.2 稀释别离法,植物病原真菌的别离一般很少用稀释法别离，但有些产生大量孢子的病原真菌和霉菌，可以配成孢子悬浮液稀释别离。,第四十页，共六十五页。,41,方法：用无菌水从发病组织外表冲下孢子，配成孢子悬浮液，用无菌移液管或滴管吸取一定体积的菌液至平板培养基上，然后用无菌玻璃棒将菌液轻轻的均匀涂布在整个平板上，或将菌液移至无菌培养皿中，然后倾入融化后冷却至45的培养基，轻轻振荡、平置、凝固后倒置培养。,第四十一页，共六十五页。,42,4.2.1 孢子别