xb三、细胞工程的技术基础.pptx

第三章细胞工程的技术根底,1,第一页，共四十八页。,第一节根本设备第二节根本技术,2,第二页，共四十八页。,第一节根本设备,一设备与器材二器材处理,3,第三页，共四十八页。,一、设备与器材 大型设备类：无菌室、超净工作台、无菌箱、CO2培养箱、倒置显微镜、实体镜、高速离心机、超速低温离心机、冰箱、超低温冰箱、液氮装置。,4,第四页，共四十八页。,5,第五页，共四十八页。,6,第六页，共四十八页。,培养箱,7,第七页，共四十八页。,8,第八页，共四十八页。,9,第九页，共四十八页。,光照培养室,10,第十页，共四十八页。,11,第十一页，共四十八页。,显微镜室,12,第十二页，共四十八页。,13,第十三页，共四十八页。,14,第十四页，共四十八页。,15,第十五页，共四十八页。,16,第十六页，共四十八页。,17,第十七页，共四十八页。,18,第十八页，共四十八页。,19,第十九页，共四十八页。,消毒灭菌设备：蒸汽压力消毒器、电热枯燥箱、过滤除菌装置、离子发生器、耐酸耐碱容器、吸管自动冲洗器、超声波清洗器；,20,第二十页，共四十八页。,灭菌室,21,第二十一页，共四十八页。,22,第二十二页，共四十八页。,23,第二十三页，共四十八页。,24,第二十四页，共四十八页。,25,第二十五页，共四十八页。,配液用具：水纯化装置、离子交换树脂装置、电子天平、磁力搅拌器、蒸发器等；制备、培养、保存细胞用品：解剖器具、80200目尼龙网或不锈钢网、血细胞计数板、培养器皿、细胞培养板不同孔数、涡流混悬器、恒温水浴振荡器、细胞冻存管、玻璃安瓿、真空低温枯燥器、厚质玻璃容器等。,26,第二十六页，共四十八页。,27,第二十七页，共四十八页。,28,第二十八页，共四十八页。,29,第二十九页，共四十八页。,30,第三十页，共四十八页。,31,第三十一页，共四十八页。,32,第三十二页，共四十八页。,33,第三十三页，共四十八页。,34,第三十四页，共四十八页。,35,第三十五页，共四十八页。,二、器材处理,玻璃器皿的清洗：浸泡刷洗浸酸冲洗 橡胶用品的处理：冲洗碱煮冲洗浸酸冲洗蒸煮清洗除菌滤器的处理：高压灭菌塑料器皿的清洗：冲洗碱浸冲洗酸浸冲洗漂洗金属器械的清洗：汽油去脂洗净酒精擦蒸煮或高压灭菌包装：包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃等，防止消毒后再污染；消毒灭菌：干烤、高压蒸汽灭菌、滤过除菌、紫外线、射线、甲醛熏蒸消毒、化学消毒剂、抗生素消毒灭菌。,36,第三十六页，共四十八页。,一、无菌技术1.各种灭菌方法及其适用范围A湿热灭菌法高压蒸汽灭菌法、常压蒸汽灭菌法、间歇灭菌法B 干热灭菌法火焰灭菌、干热灭菌C电离辐射灭菌D 紫外线杀菌E过滤除菌F化学杀菌G熏蒸灭菌法,第二节根本技术,37,第三十七页，共四十八页。,2.无菌操作过程A 清洗 玻璃器皿的清洗 实验材料的清洗B 灭菌 培养材料的灭菌以药剂灭菌法为主主要考虑：药剂的灭菌效果、材料对药剂的耐受力,38,第三十八页，共四十八页。,39,第三十九页，共四十八页。,40,第四十页，共四十八页。,培养基灭菌高压蒸汽灭菌过滤灭菌C 接种经过外表灭菌的材料，按不同的要求，经过剪切、整理后，移植到培养基上培养的过程。接种室无菌操作室的灭菌接种台的灭菌工作人员本卷须知,41,第四十一页，共四十八页。,3.实验室生物平安概念：指那些用以防止发生病原体或毒素无意中暴露及意外释放的保护原那么、技术及实践。传染性微生物的危险程度分4级1级、2级、3级、4级生物平安水平BSL相应的也分为4级BSL 1根底实验室BSL 2根底实验室BSL 3防护实验室BSL 4最高防护实验室,42,第四十二页，共四十八页。,二、细胞制备：机械分散法 淋巴细胞别离：肝素抗凝血剂+Hanks 稀释 分级别离 吸取 加其它培养液单细胞悬 胰蛋白酶 细胞 T、B细胞别离：尼龙棉柱过滤 B细胞粘附 液的制备 酶消化法 别离法 T细胞过滤 胶原酶 CD4/CD8细胞别离：SephadaG-10柱或 流式细胞分选仪 螯合剂分散法 单核/巨噬细胞别离淋巴细胞不粘，与玻面粘附 单核/巨噬细胞粘附,43,第四十三页，共四十八页。,三、细胞计数法：血细胞计数板或器 细胞分装；四、细胞培养与传代五、细胞形态学检查法：一般形态观察利用倒置显 普通染色观察Giemsa染核 微镜观察法 特殊染色法：DNAFeulgen反响、DNA-RNA 甲基-派洛宁、糖PAS、脂苏丹红II、线粒体詹纳斯绿B液、叶绿体吖啶橙,44,第四十四页，共四十八页。,吖啶橙：DNA、RNA利用荧光显微镜观察法 扫描 免疫荧光染色 透射利用电子显微镜观察法：扫描或透射。六、无血清培养液的设计和合成七、细胞的冻存、复苏与运输八、细胞培养的放大试验生产九、细胞培养时污染的检测、排除,45,第四十五页，共四十八页。,本章内容到此结束,谢谢大家,欢送研讨,46,第四十六页，共四十八页。,【复习思考题】常用的灭菌方法有哪几类？概述它们的原理。判断题：已经洗净的仪器可以用布或纸擦干。无菌操作一般要求在酒精灯火焰前10-20cm范围内进行。过滤除菌的适用对象是易被高温破坏的材料如抗生素、糖、激素等试剂。,47,第四十七页，共四十八页。,内容总结,第三章。玻璃器皿的清洗：浸泡刷洗浸酸冲洗。橡胶用品的处理：冲洗碱煮冲洗浸酸冲洗蒸煮。塑料器皿的清洗：冲洗碱浸冲洗酸浸冲洗漂洗。金属器械的清洗：汽油去脂洗净酒精擦蒸煮或高压灭菌。主要考虑：药剂的灭菌效果、材料对药剂的耐受力。经过外表灭菌的材料，按不同的要求，经过剪切、整理后，移植到培养基上培养的过程。BSL 1根底实验室。DNA-RNA 甲基-派洛宁、。47,第四十八页，共四十八页。,