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PCR技术在乙肝方面的应用.pptx
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PCR 技术 乙肝 方面 应用
PCR技术在乙肝方面的应用The application of PCR technique in HBV,涿州市医院检验科 刘鹏年,第一页,共五十五页。,Hepatitis B Virus,乙型肝炎的病原体在全世界广泛流行,估计全球半数以上人口已被HBV感染过。中国:乙肝高发区,人群HBsAg的检出率达9.8%,第二页,共五十五页。,乙型肝炎病毒感染的现状,全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒,中国有1.2亿人感染,其中每年约有1-2%会出现肝硬化或肝癌而死亡。乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病,它是由乙肝病毒(HBV)感染引起的。全世界乙肝携带者达5亿之多,我国是乙肝携带者高于人群的10。急性乙肝中有20%会转为慢性,进而可能开展为肝硬化和肝癌,因此,准确、迅速诊断对乙肝的治疗和预后显得极为重要。,第三页,共五十五页。,第四页,共五十五页。,乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科hepadnaviridae,基因组长度3.2kb 目前感染人类最小的DNA病毒 局部双链环状DNA。,第五页,共五十五页。,HBV基 因 及 编 码 蛋 白,第六页,共五十五页。,Hepatitis B Virus,第七页,共五十五页。,第八页,共五十五页。,乙肝的实验室诊断,一生化学检查 二HBV血清学检查 三HBV DNA、基因型和变异检查,第九页,共五十五页。,生化学检查,ALT和AST血清胆红素凝血酶原时间PT及PTA胆碱酯酶血清白蛋白甲胎蛋白AFP,第十页,共五十五页。,生化检测的局限性,敏感度有限代表肝细胞损害,水平上下不能代表肝储藏能力 关于“胆酶别离现象,第十一页,共五十五页。,HBV血清学检查,工程:HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBc IgM方法ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay,最常用,定性)发光免疫分析(定量),第十二页,共五十五页。,HBsAg 感染的标志Anti-HBs 既往感染/接种疫苗Anti-HBc IgM 急性感染标志Anti-HBc IgG 既往或慢性感染HBeAg 急性病毒复制,有传染性 Anti-HBe 病毒不再复制HBV-DNA 急性病毒复制,比HBeAg更准确;主要用于监测治疗反响,第十三页,共五十五页。,血清学检测的临床意义,HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc 临床意义,急性或慢性感染(大三阳),+,-,+,-,+,+,+,+,乙肝后期或慢性感染(小三阳),-,-,+,+,-,-,-,潜伏期或急性乙肝早期,-,-,+,+,+,痊愈或恢复期,有免疫力,-,-,-,-,-,+,+,+,-,-,痊愈,有免疫力,疫苗接种或曾经感染过,有免疫力,第十四页,共五十五页。,血清学检测的局限性,HBV具有“检测窗口期假阴性结果无法检测突变株及抗体,第十五页,共五十五页。,Symptoms,HBeAg,anti-HBe,IgG anti-HBc,IgM anti-HBc,anti-HBs,HBsAg,0,4,8,12,16,20,24,28,32,36,52,100,Acute HBV Infection with Recovery,Typical Serologic Course,Weeks after Exposure,Titre,第十六页,共五十五页。,IgM anti-HBc,IgG anti-HBc,HBsAg,Acute(6 months),HBeAg,Chronic(Years),anti-HBe,0,4,8,12,16,20,24,28,32,36,52,Years,Weeks after Exposure,Titre,Progression to Chronic HBV Infection,Typical Serologic Course,第十七页,共五十五页。,第十八页,共五十五页。,PCR技术检测HBV DNA,PCR聚合酶链式反响于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立,并和定点突变的创造者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖,为生命科学领域的研究开创了崭新时代。,第十九页,共五十五页。,PCR概念 PCRPolymerase Chain Reaction即聚合酶链式反响,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。,第二十页,共五十五页。,PCR反响的特点,特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高 指数增长,从pg(10-12)可扩增至 mg(10-6)水平 简便、快速 2小时完成扩增对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板,第二十一页,共五十五页。,PCR反响过程,DNA的体外复制包括3个步骤:变性denaturation:94 C 30s 退火annealing:55 C 30s延伸extension:72 C 30-60s 3个步骤作为PCR的一个循环,每当完成一个循环,一个分子的模板被复制为二个,产物量以指数形式增长。,第二十二页,共五十五页。,第二十三页,共五十五页。,第二十四页,共五十五页。,普通PCR技术的缺点,普通PCR临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题,但由于假阳性率高,不能正确指导临床实践。因此国家卫生部曾在1997年行文禁止将普通PCR技术用于临床诊断。,第二十五页,共五十五页。,定量PCR的特点,采用闭管检测,不需PCR后处理,并采用dUTP-UNG酶的防污染系统,扩增和检测一次同时完成。不需开盖,不产生污染。防止了假阳性。探针与被检DNA序列特异杂交,增强了特异性。,第二十六页,共五十五页。,定量PCR的特点,可定量结果,准确灵敏地反响了病原体的感染和治疗恢复情况。光谱分析仪直读结果,自动分析,增强了灵敏性和客观性。,第二十七页,共五十五页。,HBV DNA检测方法的比较,斑点杂交 PCR 定量PCR敏感性 低 较高 高特异性 高 稍低 高重复性 好 稍差 好定量范围 4 6 6简便 较繁琐 简便 简便平安性 好 稍差 好设备 廉价 稍贵 昂贵技术要求 低 高 高检测价格 低 中 高,第二十八页,共五十五页。,为什么建议每个病人都要进行HBV DNA检测?,第二十九页,共五十五页。,HBV DNA检测的临床意义 诊断方面:HBV DNA是HBV存在最直接的依据 HBV DNA是HBV复制的标志 HBV DNA是患者具有传染性的标志,第三十页,共五十五页。,HBV DNA检测的临床意义,对HBV-M起补充作用:HBeAg()/抗HBe()乙型肝炎 前C区变异 HBsAg()乙型肝炎 S区变异 低水平感染 单项抗HBc()乙型肝炎,第三十一页,共五十五页。,HBV基 因 及 编 码 蛋 白,第三十二页,共五十五页。,HBV DNA检测的临床意义,疗效判断:HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标 预后判断 HBV DNA水平与病情有一定的关系,第三十三页,共五十五页。,HBV-M与HBV DNA关系 广东 四川 湖南 解放军 南方医院“大三阳 86.2 85.0 87.3 94.38 93.4“小三阳 35.1 20.3 25.6 27.3 23.8“小二阳 40.7 27.6 48.8 38.56 30.5 抗HBc 11.5 10.8 19.3 抗HBs 3.6 0 9.7 0 三抗体阳 5.0 1.1 10.0 全阴 0 4.0调查总例数 1474 2828 814 838 773HBV DNA阳性率,第三十四页,共五十五页。,HBV DNA检测的临床意义,调查说明并不是所有“大三阳的病人都处于HBV复制期,具有传染性;也不是所有“小三阳的病人HBV都无复制。因此,要准确知道HBV是否处于复制状态,最准确的方法还是通过检测HBV DNA来决定。,第三十五页,共五十五页。,HBV-DNA定量检测的临床应用,慢性乙肝诊断治疗监测和疗效评价跟踪随访预后判断,第三十六页,共五十五页。,HBV-DNA定量 慢性乙肝的诊断,HBsAg阳性六个月以上ALT持续升高或反复升高HBV-DNA大于105拷贝/毫升HBeAg阳性或104拷贝/毫升HBeAg阴性,第三十七页,共五十五页。,HBV-DNA定量 慢性乙肝的治疗监测,治疗前检测患者的基线水平ALT、HBV-DNA治疗开始后前三个月每月一次、以后每三个月一次检测ALT、HBV-DNA,对于HBeAg阳性患者,还需检测HBeAg如果治疗期间HBV-DNA水平降低两个数量级,可以认为治疗有效,第三十八页,共五十五页。,HBV-DNA定量 治疗后的随访,无论有否治疗应答,都应对患者定期随访。建议停药后的前3个月每月1次、以后每36个月1次检测ALT、AST、HBV血清标志物和HBV DNA,以及临床表现和不良反响。随访至少6-12个月。如病情有变化,可随时随访。,第三十九页,共五十五页。,HBV拉米夫定耐药,虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著,但长期使用拉米夫定会出现耐药现象使用一年、二年、三年、四年的耐药比率为:15-32%、38%、56%、67%一旦出现拉米夫定耐药突变YMDD变异,大多数患者会在2-4个月之内出现HBV-DNA和ALT反弹,第四十页,共五十五页。,YMDD变异,YMDD 酪氨酸蛋氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸。如发生YMDD变异,那么其中的蛋氨酸M突变为异亮氨酸isoleucine,I或缬氨酸valine,V形成YIDD变异株或YVDD变异株。YMDD位于HBV多聚酶的关键功能区。,第四十一页,共五十五页。,YMDD变异检测,采用实时荧光定量PCR方法,不仅能够检测出现的突变类型YVDD或YIDD,而且能够确定突变株所占比例,对及时调整治疗方案具有非常重要的意义能够准确稳定的检测到1%的突变株,能够更早发现耐药突变,尽早调整治疗方案,第四十二页,共五十五页。,HBV 拉米夫定耐药突变检测原理,HBV检测I突变检测V突变检测,第四十三页,共五十五页。,什么时候开始检测YMDD变异,拉米夫定治疗过程中YMDD变异情况治疗时间 HBV DNA大于104copies/ml例数 YMDD变异例数*6个月 6117%612个月261454%1224个月382668%2436个月3838100%*各组之间两两比较均有显著差异P0.05。,第四十四页,共五十五页。,YMDD变异株的动态变化,第四十五页,共五十五页。,YMDD变异株的动态变化,第四十六页,共五十五页。,YMDD检测应用方法,对接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者进行耐药监测治疗前检测一次约有10-20%的人在治疗前就有YMDD变异治疗开始后第七个月开始,每三个月检测一次,第四十七页,共五十五页。,慢性乙肝的基因分型,乙肝病毒分八个基因型:根据基因组序列的差异可以分为AH八种亚型,我国以B型41%和C型53%为主不同基因型病毒感染的病程和后果不同:C型对肝的损伤比B型严重,基因型C比基因型B更容易开展成为肝硬化不同的基因型对药物的应答也不一样:基因型B比基因型C对干扰素治疗更敏感,第四十八页,共五十五页。,共价闭合环状DNA(cccDNA)检测,HBV cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板只有彻底去除了cccDNA,乙肝的治疗才能算真正有效HBV cccDNA可作为评价抗病毒治疗效果新的有效指标,第四十九页,共五十五页。,HBV基 因 及 编 码 蛋 白,第五十页,共五十五页。,阿德福韦治疗乙型肝炎,阿德福韦为5-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物,可明显抑制HBV DNA复制 HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者,1、2、3年时的耐药发生率分别为0%、1.6%、3.1%HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分别为0%、3.0%、5.9%11%,第五十一页,共五十五页。,1896突变的诊疗意义,G1896A点突变,形

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