B-02-水体中大肠菌群测定资料.pptx

Central Laboratory of Biology,水体中大肠菌群的测定,微生物学实验,第一页，共二十页。,【课前预习】,1.典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？2.食品中大肠菌群数测定的意义是什么？,第二页，共二十页。,【目的要求】,1.学习和掌握大肠菌群的测定方法多管发酵法2.了解测定过程中每一步的反响原理。3.了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性,第三页，共二十页。,【实验原理】,大肠菌群是一群能在37培养48h内发酵乳糖产酸、产气的需氧或兼氧革兰氏染色阴性无芽抱杆菌。以大肠杆菌为主，包括肠细菌属、柠檬酸细菌属、埃希氏菌属和克雷伯氏菌属等。大肠菌群在肠道和粪便中数量非常高，且与肠道和粪便中的病原菌生活习性相近，可作为判断样品是否被人、畜粪便污染的标志。,第四页，共二十页。,发酵法：又称多管发酵法或三步发酵法(此法是根据大肠菌群具有发酵乳糖产酸产气的特性，利用含乳糖的培养基培养不同稀释度的样品经初发酵、平板别离和复发酵3个检测步骤，最后根据结果查最大自然数most probable number表，算出食品中的大肠菌群数。),第五页，共二十页。,1)初发酵推测试验：将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳糖等糖类的培养液中3倍或1倍乳糖培养基，视所加的水样体积和培养基体积而定，经37 C培养24 h，观察产酸产气情况，以初步判断是否有大肠菌群存在。,第六页，共二十页。,发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。,第七页，共二十页。,2平皿别离证实试验,水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基，37 C培养24 h，根据菌落特征，挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。,第八页，共二十页。,平板培养基使用伊红美蓝琼脂eosin methyleneblue agar，EMB agar。伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色龙胆紫的紫色阳性菌落。初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产气的均需在以上平板上划线别离菌落。,第九页，共二十页。,3 复发酵试验(完成实验,将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入1倍乳糖培养液中，经37 C培养24 h，产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。产酸、产气分别记为阳性反响，不产酸、产气那么记为阴性反响；根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。,第十页，共二十页。,1.被检样品根据不同需要选择检检样品如自来水、湖水等2.培养基乳糖胆盐发酵培养基，伊红美蓝固体培养基，乳糖发酵培养基3.试剂革兰氏染色液，芽孢染色液4.其它显微镜，天平，培养箱，水浴锅，研钵，平皿，试管，刻度吸管，涂布器,【实验材料】,第十一页，共二十页。,【操作步骤】,1水样的采取青山湖水，应取距水面10-15cm的深层水样，用灭菌带玻璃塞的瓶子，瓶口向下侵入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水既流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出,第十二页，共二十页。,2湖水的检查1初步发酵实验 水样的稀释：10-2、10-3、10-4 用无菌水稀释 接种：取0.5ml上三个稀释度的水样接入装有4.5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管水样的体积和培养液的体积由试管而定，混匀后，37 培养24 h。,第十三页，共二十页。,水样接种于发酵管内，37下培养：124h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，疑为阳性结果；2在量少的情况下，也可能延迟48h后才产酸产气，此时应视为可疑结果。以上两种结果均需继续做下面两局部实验，才能确定是否是大肠菌群。348h后仍不产气的为阴性结果。,第十四页，共二十页。,2平板别离 将经24 h培养后产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37 培养1824 h，将符合以下特征的菌落进行染色镜检。深紫黑色，有金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深。,第十五页，共二十页。,3复发酵试验 将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌株重复初步发酵试验(利用乳糖蛋白胨培养液)。仍为产酸产气者为大肠杆菌阳性。4 结果计算：根据三个稀释度中阳性管数组成一个数量指标，查MPN计数表10-1,第十六页，共二十页。,第十七页，共二十页。,【实验结果】,1.将实验测出的各样品大肠菌群数以报表方式报告结果。2.对样品大肠菌落数作出是否符合卫生要求的结论。,第十八页，共二十页。,【思考题】,1.在进行食品中大肠杆菌群数的测定时，为什么要进行复发酵试验？2.典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？3.食品中大肠菌群数测定的意义是什么？,生物学实验教学中心,第十九页，共二十页。,内容总结,Central Laboratory of Biology。3.了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。类的培养液中3倍或1倍乳糖培养基，视所加的水样。根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。1.被检样品根据不同需要选择检检样品如自来水、湖水等。3.试剂革兰氏染色液，芽孢染色液。1.在进行食品中大肠杆菌群数的测定时，为什么要进行复发酵试验。生物学实验教学中心,第二十页，共二十页。,