43血红蛋白提取.pptx

课题3 血红蛋白的提取和分离,裳骋磨浑穆蕾休撕殉陇倘睹羹佑摄宜磷怖耙遏没镐穷揣儡迟怀佣惧家舵俄43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第一页，共五十一页。,2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组时代。,人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息。,蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究,梆堪瓷磕让减总垮踊何氟瑶撇浑凳谊絮祥弓梭醋寝蒸劝会葵罐骚捌泅顿贡43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第二页，共五十一页。,思考1 别离生物大分子的根本思路是什么？,选用一定的物理或化学的方法别离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,思考2 蛋白质的别离和提取的原理是什么？,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来别离不同蛋白质。,航氮隧人套慈煎织栅靴兼睁纠县意串粥欺蒋拥长苏硒测叫褒啪我径土埃洽43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第三页，共五十一页。,冤燃嗅叮漓屯肥述籍佰弧疽旷忧响兜哭在梢蛇膏蜂勋册砧冲并瘤泰憎戌冠43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第四页，共五十一页。,思考3 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？,变性、变性、空间结构,思考4 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人(猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,吓诸潘邻桃揍胡税蜜肖谜好懂锹座假设袋怠疤涪弧绢谈惺铰腾淖欠促势舀射43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第五页，共五十一页。,一、根底知识：,凝胶色谱法分配色谱法：,1、凝胶：,一些微小多孔的球体内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛,2、概念：根据被别离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行别离。,靡畅于络桥扣静册谦檬馋女汇勿抨绦饺肚涎横杠狂弧添仅渐措簇柞谐衍鸽43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第六页，共五十一页。,3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程，移动速度，而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程，移动速度，相对分子质量不同的蛋白质因此得以别离。,4、具体过程,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,饰霍刽货华猩黄赴喘患焚姆孰堤坎隧涪鹤浴后曰犀脯嘘舞鳞咕喀枝固惋末43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第七页，共五十一页。,曼萝读嘘帝栈才瞪哗孤谁容豫韩烙法逻酬萌拧硕仰就慢尘缠味祭眷太炽举43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第八页，共五十一页。,嘱绝钮似万奄聚瑰连霄叔势小峪卉蒸猾惰湿螟鼻编桅惋保讼僻阜蝴从剁传43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第九页，共五十一页。,1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,缓冲溶液：,2、作用：能够抵抗 对溶液的 的影响，维持PH根本不变。,外界的酸或碱,PH值,俐富弟宫移况信币桌誊挺契瘸闰戊掸香痰砸森目宛胀鹤变门凋矫辆戍澳晶43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第十页，共五十一页。,3、缓冲溶液的配制,通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液。,12,使用比例,在不同PH范围内,思考：说出人体血液中缓冲对。,NaH2PO4/Na2HPO4,H2CO3/NaHCO3,黍圾鞭应秧股培液柞能拎坑贾鲤台沿雷非剃厢昂附漆簿苍肤簇浸络忍攻捐43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第十一页，共五十一页。,电泳：,1、概念：指带电粒子在电场作用下发生 迁移的过程。,思考：在血红蛋白的提取和别离实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？,使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察红色和材料的科学研究活性,阑崔众扰飞挨臻溜歹康辆萤甸炕潍邵铂过啃否逛缠奎荤骆权锯蜘郡某估颧43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第十二页，共五十一页。,2、原理：许多重要的生物大分子，如 等都具有()在()下，这些基团会带上。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 移动。电泳利用了待别离样品中各种分子 以及分子本身、的不同使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的别离。,多肽、核酸,可解离的基团,正电或负电,所带电荷相反的电极,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,一定的PH,州苞锰诺额缺陋舟莫伟愈骂勾拯犊咙允进双奄褒探装拿稀汁翰英繁袒胖诧43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第十三页，共五十一页。,枯海韦掌喊鄂拱姚酥矾窘隋凭蜗空采贼岳韵孺仓要饼息竭躯决莽沼滤凰颁43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第十四页，共五十一页。,聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和催化剂四甲基已二胺的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,分类：,琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。,测定 通常用十二烷基硫酸钠SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳,蛋白质相对分子质量,名兜坡壕敝粕甘闻宇叠雀斗损只杠玩辞杠属氓块沏商镑嘱衫潜贩削佩奎称43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第十五页，共五十一页。,二 实验操作,蛋白质的提取和别离一般分为四步：,1.样品处理,血液,血浆,水分,固体物质,血浆蛋白,无机盐磷脂葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞最多,血红蛋白,两个a肽链,两个一肽链,样品处理粗别离纯化纯度鉴定,共四条肽链,90,硫哑宦镇聘释汇核呛矮煤级借拎躺札曳眯搔虽境疽起鞭鸥彭烁疮瀑灿栈冬43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第十六页，共五十一页。,袜瞧酌籽恶傅棍园抗齐甜史付孟血眨衍悟拔邹口偏盆返穷强项初绷疯晕台43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第十七页，共五十一页。,目的：去除 方法：离心速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到别离的效果，然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层 的红细胞液体倒入,每个肽链环绕，此基团可携带。血红蛋白因含有 而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来别离血红蛋白。,一个亚铁血红素基团,一分子氧或一分子二氧化碳,血红素,(1)红细胞的洗涤,杂质蛋白,低速短时间,黄色血浆,暗红色,烧杯,洁去硅幸墙秃雨氏涕堤元稼纯眨桩熄备肤过灵窿鼓酿宏照邪碘苟峻睁须派43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第十八页，共五十一页。,再参加用 的 质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤低速离心低速短时间,重复4、5步骤 次，直至上清液中已没有，说明洗涤干净。利于后续血红蛋白的别离纯化，不可洗涤次数过少。,五倍体积,生理盐水,三,黄色,沧昼鬼瓣世蛔擒胞径抠诉撂魏罐厄芹妆邵组惭就裂咆欲趁舵骤着迪做橇褥43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第十九页，共五十一页。,(2)血红蛋白的释放,加 到 体积，再加40体积的 溶解细胞膜，置于 上充分搅拌10分钟加速细胞破裂,细胞破裂释放出血红蛋白.,(3)别离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min，试管中的溶液分为4层:,原血液,甲苯,磁力搅拌器,蒸馏水,倪皋情哄铰磅喻春帛呈桔章胞母惨州码茵哨钒绩嘘士臼舆堰拴初舔邵骸隧43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第二十页，共五十一页。,第1层最上层：甲苯层,第2层中上层：的沉淀层，色薄层固体,第3层中下层：的水溶液层 的液体,第4层最下层：其它杂质 的沉淀层,无色透明,脂溶性物质,白,血红蛋白,红色透明,暗红色,滥哩哺伤主倒席蒜颧九思帜厅磋自越馈考雍寇捌涕诛持幅氨杉但力咯掉屡43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第二十一页，共五十一页。,用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,邦译吓锌虽净潜莉艺扦佩诗液绎咏漠站苇准想碘明振母尚缸忌鸦舵孕柠僚43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第二十二页，共五十一页。,取()ml的血红蛋白溶液装入 中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的 中，pH为，透析12小时，目的是 或用于更换样品中的。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。,除去样品中分子量较小的杂质,透析袋,磷酸缓冲液,7.0,缓冲液,(4)透析,1,付净阑又侮择瑰发污放厨盐猛址炕喊韩蹄姆忻容幸琵鄙契熙悉换框嚣嫁段43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第二十三页，共五十一页。,猿矩郸掉霍扩挥怂补寓内梗朋燕坏霄韵妨孔逞梳濒馈认淑梯柒平樟补竿千43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第二十四页，共五十一页。,2.凝胶色谱制作,1凝胶色谱柱的制作,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。,底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。a、选择适宜的的橡皮塞，中间打孔；b、在橡皮塞顶部切出锅底状的，在0.5ml的 头部切下 长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。,凹穴,移液管,5cm,腻黔巴难巷问唇窒烈氏拿慷猩驾馏丙每办况扩糠殆厚订越年纵织矫假恶橱43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第二十五页，共五十一页。,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否那么难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质别离不彻底。,注意,c.剪尼龙网小圆片覆盖在 上，用 的尼龙纱将橡皮塞 包好，插到玻璃管一端。d、色谱柱下端用移液头部做，连接一细的，并用螺旋夹控制尼龙管的，另一端放入收集 的收集器内,橡皮塞的凹面,100目,上部,出口部位,尼龙管,翻开与关闭,色谱流出液,诚冯搅蔡菲斤坡且毫霸漠酱蒸郡捻汲滁哮蓄督朔卤句拓斡绑娄弃饵宜眨彰43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第二十六页，共五十一页。,安装其他附属结构。,顶塞的制作：,插入安装了玻璃管的橡皮塞,组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。,享蛛化匆簇郴核助旱铜竟诅抉拢琼杂恫端用需服势轻郁烂晋爹埔寻辽帅战43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第二十七页，共五十一页。,2凝胶色谱柱填料的处理,1凝胶的选择：G-75“G表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及别离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶 膨胀时吸水7.5克。,2方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀后，配成。,蒸馏水,凝胶悬浮液,交联葡聚糖凝胶,试川恍蝉傈漳亲膏种傻名蓝绍蠕彰铂材踏琼弱忌暖氨崭骤卢龄秀刁赁永芝43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第二十八页，共五十一页。,固定：将色谱柱处置固定在支架上,装填：将 一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。,3凝胶色谱柱的装填方法,凝胶悬浮液,色谱柱,注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低别离效果。,皂嫉野窗皱豫拦固嗣伪扎死脾遭菌褒孪共忆快始朵需惑数盅顷蝶谍曙呵息43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第二十九页，共五十一页。,洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在()高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液pH为7.0充分 12小时。,洗涤平衡,注意液面不要低于凝胶外表，否那么可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的别离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否那么重新填装。,50cm,钞拓凄淌蜂夜税业奠积猩亭鲤勿帚巨花炒之报阎随芳湖摧籍望七冷蜂择挛43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第三十页，共五十一页。,3样品参加与洗脱,加样前,翻开下端出口，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐，关闭出口,缓冲液,凝胶面,眺区挨赛助袍消撵停迸跋酷净豺舱鸥卯尊妨掩军跑貉栋埋炊厩岸孽擎足匀43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第三十一页，共五十一页。,加透析样品,秧检腑威缉瑞颂嵌靴冀着爹庚宴鹃是税宇档填奋靶屏评冀永申廊誓嵌稽稍43血红蛋白提取43血红蛋白提取,第三十二页，共五十一页。,调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用 将1ml 的