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参与DNA复制有关的酶和蛋白质,第一页，共五十二页。,现在已经知道约20多种蛋白质参与复制。1聚合酶2解 链、解 旋 酶 类3引发酶4连接酶 下表是与大肠杆菌复制有关的蛋白质。,第二页，共五十二页。,表 与大肠杆菌复制有关的蛋白质,接下页,BACK,第三页，共五十二页。,Rep蛋白是一种大肠杆菌解链酶,第四页，共五十二页。,1 DNA聚合酶 DNA聚合酶 是指以脱氧核苷三磷酸作为底物催化合成DNA的一类酶。,全称：DNA依赖的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol,活性：1.53 的聚合活性2.核酸外切酶活性,第五页，共五十二页。,所有DNA聚合酶的作用方式根本相似。它们催化脱氧核苷三磷酸加到复制中的DNA链的3羟基末端，合成方向从53，由模板决定加上何种脱氧核苷酸。,第六页，共五十二页。,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段和RNA引物。,能识别错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,目 录,第七页，共五十二页。,第八页，共五十二页。,DNA聚合酶的分类,DNA-pol 主要的修复酶DNA-pol 次要的修复酶DNA-pol 复制酶DNA-pol IV SOS修复DNA-pol V SOS修复,原核生物的聚合酶,第九页，共五十二页。,(1)大肠杆菌DNA聚合酶I(Pol)纯的DNA聚合酶I由分子量109 000U(109KD)，含928个氨基酸残基的一条肽链构成，每个大肠杆菌细胞中大约含400个酶分子。(单链多肽,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,第十页，共五十二页。,323个氨基酸,小片段34KD,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段 76KD,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶,DNA-pol,第十一页，共五十二页。,DNA聚合酶的多种活性。53聚合活性：在模板指导下，以脱氧核苷三磷酸为底物在引物3-OH末端加上脱氧核苷酸。每个酶分子每分钟添加1 000个单核苷酸。聚合酶催化的DNA的合成需要以下条件：模板 四种脱氧核苷酸 必须有一 3-OH末端的引物，且此引物必须与模板正确形成氢键 合成从53方向进行，如图7-8和图7-9所示,第十二页，共五十二页。,第十三页，共五十二页。,35外切酶活性：没有脱氧核苷三磷酸底物时，DNA聚合酶 I 能从3-OH开始以35方向水解DNA，产生5-单核苷酸。实际上DNA复制时，加上去的脱氧核苷酸不一定每次都正确，错误的时机不少，有时甚至加上一个不与模板配对的核苷酸，当3-OH末端的碱基不与模板配对时聚合酶就无聚合活性，此时它具有的35外切酶活性可以切除这个不配对的核苷酸，这一碱基切除后，外切核酸酶活性终止，聚合酶活性恢复，如图7-10所示。所以聚合酶的35外切酶活性也叫修补活性。,第十四页，共五十二页。,第十五页，共五十二页。,53外切酶活性：DNA聚合酶I具有53外切酶活性。如图7-11，其特点是：只能在5-P末端一个接一个地切除核苷酸；能连续地切除多个核苷酸；只切除配对的5-P末端核苷酸，不切除不配对的单链5-P末端核苷酸；既能切除脱氧核苷酸也能切除核苷酸；对只具有5-P末端的切口也有活性由于在DNA复制过程中一般情况下只在RNA引物处才有缺口，因此53外切酶活性的主要功能是切除核糖核苷酸引物。,第十六页，共五十二页。,第十七页，共五十二页。,切口翻译(nicktranslation)DNA聚合酶 I 的53外切酶活性和聚合活性同时作用可以进行切口翻译(nicktranslation)，用来制造放射性探针。在反响物里参加同位素标记的脱氧单核苷酸，DNA聚合酶I 首先利用53外切酶活性，从切口处逐个切下DNA上的核苷酸，再利用3-OH末端聚合作用逐个将标记的核苷酸加上去(图712)。,第十八页，共五十二页。,5,3,5,3,第十九页，共五十二页。,内切酶活性：DNA聚合酶 I 也具有53 内切酶活性，如图7-13所示。在两个碱基之间切开产生一个具有5-P 末端的不配对碱基的片段。很多实验证明DNA聚合酶 I 在大肠杆菌复制中不是主要的合成酶，而是在除去RNA引物和损伤修复中起重要作用。,第二十页，共五十二页。,不配对的片段,内切酶活性,第二十一页，共五十二页。,2 大肠杆菌 DNA聚合酶 DNA聚合酶缺陷的突变株仍能生存，这说明DNApol不是DNA复制的主要聚合酶。人们开始寻找另外的DNA聚合酶，并于1970年发现了DNApol。从53方向合成DNA 具有35外切酶活性，但没有53外切酶活性。在体外的合成速率比体内的速率要低得多，带有这个酶缺陷的大肠杆菌突变株染色体的复制各方面都正常，它在体内的功能可能和DNA聚合酶 I 类似。,第二十二页，共五十二页。,(3)大肠杆菌DNA聚合酶 聚合酶是体内DNA复制所必需的酶 带有DNA聚合酶 的温度敏感突变(polc)的大肠杆菌在限制温度下是不能存活的，从这种菌株得到的裂解液也不能合成DNA，当参加正常细菌的DNA 聚合酶 时可以恢复它的聚合能力，因此不同于DNA聚合酶I和，聚合酶是体内DNA复制所必需的酶。DNA多聚酶相当复杂，其结构和各亚基的功能如图1124，25所示。DNA pol 具有53聚合功能。,第二十三页，共五十二页。,DNA聚合酶 的“核心酶由、三种亚基组成。亚基具有合成DNA的能力。亚基具有35外切酶的功能，起到校正的作用。亚基可能在组装中发挥功能。,亚基加到核心酶上使其二聚化，进一步产生pol III。复合体参加到pol，进一步形成 pol 复合体。复合体是由，和亚基组成，其作用是固定亚基这个“夹子的支架。亚基：形成夹钳，保持催化核心和模板链的结合,第二十四页，共五十二页。,聚合酶的活性 聚合活性：DNA复制时聚合酶 全酶十分重要，它可以在DNA模板上的引物的3-OH上以每分钟约50 000核苷酸的速率逐个延伸新生的DNA。35和53的外切酶活性：pol 的53外切酶活性与pol的不同，pol 的53外切酶活性只对 单链 DNA有作用，因此不能用于缺口翻译。DNA聚合酶的作用范围如图7-14所示。,第二十五页，共五十二页。,第二十六页，共五十二页。,E.Coli中的DNA聚合酶,第二十七页，共五十二页。,(4)真核生物中的DNA聚合酶 所有真核生物中的聚合酶的性质根本上同大肠杆菌中的聚合酶相似，它的活性有赖于模板，带3-OH的引物，四种脱氧核糖核苷磷酸。目前发现的真核生物DNA聚合酶有。DNA聚合酶：在迅速增殖的细胞中活力较高。酶分子量在165,000一175,000U之间。最适宜的底物是带缺口的双链DNA，但是带引物的变性DNA也是很好的底物。是真核生物的复制酶。它同大肠杆菌DNA聚合酶最大不同之处在于不具外切酶活性。,第二十八页，共五十二页。,DNA聚合酶(损伤修复)：为分子量较小(43,000U)的聚合酶。在整个细胞周期中它的活力没有变化，它利用Dnase I 处理过的天然DNA作模板，对变性DNA几乎没有活性，不具外切酶的活性。DNA聚合酶线粒体：是一个大分子酶，在细胞内含量很低，因此不容易纯化。这个酶可以使用带缺口的DNA作底物，但以多聚(A)、寡聚(dT)8-10作为底物，酶活力更高。DNA聚合酶负责线粒体DNA的复制。DNA聚合酶和DNA聚合酶主要复制酶:是真核生物的复制酶，主要根据是聚合酶的活性随细胞周期而变化。DNA聚合酶：功能不详。,第二十九页，共五十二页。,2 DNA连接酶 DNA Ligase DNA连接酶催化一个DNA链的5磷酸根与另一DNA链的3羟基形成磷酸二酯键。但两个链都必须与同一另外的链互补结合，而且两链必须相邻，即只能连接一个切口(nick)而不能连接一个豁口(gap)(丧失核苷酸)，如图7-15所示。例子：T4诱导的连接酶不仅能在模板上连接DNA和DNA之间的切口，也能连接RNA和RNA之间的切口，不仅能连接DNA中的单链切口或双链的粘性末端，而且能连接平头双链DNA。大肠杆菌连接酶那么不行。,第三十页，共五十二页。,第三十一页，共五十二页。,3 与解链有关的酶和蛋白质 DNA是双螺旋，在复制中双螺旋要解开，双螺旋的解开使得复制叉前面产生正超螺旋，如果这些应力不以某种方式释放将阻碍复制叉前进。现在已找到一些酶和蛋白质，它们或者能使DNA双链变得易于解开，或者可以使超螺旋分子松弛，以下介绍一些这类蛋白质。,第三十二页，共五十二页。,(1)单链结合蛋白(SSB蛋白)SSB蛋白：是缺乏酶活性的复制辅助蛋白，可以在远低于Tm的温度下使双链DNA拆开，并牢牢地结合在单链DNA上，稳定单链区域的蛋白质。SSB保护复制中的DNA单链局部不被核酸酶降解 首先在大肠杆菌中发现，后来发现许多种生物中都有这类蛋白质。在文献中，这类蛋白曾用过多种名称：解旋蛋白(unwindingproteill)，熔化蛋白(mel2ingprptein)，螺旋降稳蛋白(helixdestabizingprotein)。,第三十三页，共五十二页。,(2)解链酶DNA解旋酶；DNA helicases 解链酶(解螺旋酶)：是一类能通过水解ATP获得能量来解开双链DNA的酶称为DNA解链酶。解链酶依赖于单链DNA 的存在 分解ATP获得能量 具引发酶的功能合成小片段的RNA作为后随链的引物 如果双链DNA中有单链末端或缺口，那么DNA解链酶可以首先结合在这一局部，然后逐步向双链方向移动，复制时大局部DNA解链酶可以沿着后随链模板的53方向随着复制叉的前进而移动，只有rep蛋白一种大肠杆菌解链酶是沿前导链模板的35方向移动。因此在复制时rep蛋白和某DNA解链酶分别在DNA的两条母链上协同作用以解开双链DNA图7-16,第三十四页，共五十二页。,第三十五页，共五十二页。,第三十六页，共五十二页。,(3)拓扑异构酶(Topoisomerase)：是催化DNA拓扑异构体(Topoisomer)相互转换的一类酶。拓扑异构酶能与DNA形成共价结合的蛋白质-DNA中间体，从而在其骨架的磷酸二酯键处造成暂时性裂口，使DNA的多核苷酸链得以穿越，从而改变DNA分子的拓扑状态。根据酶作用的机理及其介导一条链还是二条链的断裂，拓扑异构酶可分为型和型。,第三十七页，共五十二页。,型拓扑异构酶的共同特点是：仅切断双链DNA中的一条链，即催化瞬时的单链断裂和连接。不需要能量辅助因子，如ATP和NAD等，因此不能催化需能的超螺旋化结构。型拓扑异构酶一般都使高度超螺旋的DNA松弛。型拓扑异构酶的共同特点是：同时切断、缝合DNA的两条链。需要能量辅助因子，可以作用于任何相交的两对双链DNA。,第三十八页，共五十二页。,大肠杆菌拓扑异构酶I属于型酶 概述：拓扑异构酶(E.coli)催化负超螺旋DNA的松弛。拓扑异构酶也参与DNA的打结和解结。将两个互补的单链DNA环耦合为双链DNA环。完整的全酶是一分子量97 kDa的蛋白。,第三十九页，共五十二页。,大肠杆菌拓扑异构酶 I 的特点是：仅切断双链DNA中的单链并催化瞬时的单链断裂和连接。由于反响的产物还是闭环DNA，因此，酶反响机制是先切开双链DNA中的一条链，使切开链的末端沿螺旋的方向转动，然后把切口封起来，到达松旋的目的。不需要能量辅助因子。如：ATP NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，最初从大肠杆菌中别离到一种叫蛋白，后来定名为大肠杆菌拓扑异构酶 I。,第四十页，共五十二页。,Structure of the Topo I/contact with DNA,第四十一页，共五十二页。,后来发现这种酶广泛存在于各种生物中，不同学者曾给予各种命名：转轴酶(swivelase)，松旋酶(untwisting enzyme)，DNA松弛酶(DNA relaxing enzyme)，切割封口酶(nickingclosing enzyme)。Topo I 酶松弛超螺旋DNA时不需要ATP，它可以催化三种拓扑转换反响(图7-