2022年医学专题—第十四章免疫细胞的分离与检测.ppt

,Separation and Assays for Immune Cells,免疫细胞(xbo)的分离与检测,第一页，共九十五页。,免疫(miny)细胞的种类,淋巴细胞：T细胞(xbo)、B细胞、NK细胞等单核巨噬细胞树突状细胞粒细胞,第二页，共九十五页。,分离(fnl)免疫细胞的样本来源,外周血脾脏(pzng)淋巴结胸腺骨髓,第三页，共九十五页。,分离免疫(miny)细胞的目的,检测免疫细胞的数量和功能，观察机体(jt)免疫状态免疫细胞的细胞生物学研究免疫细胞的培养和建株,第四页，共九十五页。,分离免疫细胞(xbo)的一般原理,物理学和生物学特征密度大小表面标志(biozh)其它活性：吞噬、黏附等,第五页，共九十五页。,本章(bn zhn)主要内容,1.免疫细胞(xbo)的分离与纯化,2.淋巴细胞的数量(shling)检测,4.吞噬细胞功能检测,3.淋巴细胞的功能检测,第六页，共九十五页。,第一节 免疫(miny)细胞的分离与纯化,白细胞的分离 外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞和单核细胞的分离与纯化(chn hu)淋巴细胞亚群的分离 细胞活力的检测,第七页，共九十五页。,一、白细胞的分离(fnl),细胞密度不同，沉降速度不一样(yyng)。粒细胞1.092,红细胞1.093,沉降速度不一样。自然沉降法(血浆、白细胞、红细胞)聚合物加速沉降法：明胶、右旋糖酐、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。(会增加白细胞的黏性),第八页，共九十五页。,二、外周血单个核细胞(xbo)的分离,外周血细胞(xbo)的密度 血小板：1.030-1.035 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 粒细胞：1.092 红细胞：1.093,外周血单个核细胞(xbo)(peripheral blood mononuclear cell,PBMC):Monocyte、Lymphocyte,第九页，共九十五页。,聚蔗糖(zhtng)（Ficoll）泛影葡胺分层液法,（一）原理(yunl)和方法,1.单次密度梯度分离法 单次密度梯度 连续(linx)密度梯度,第十页，共九十五页。,2.试剂(shj)：FicollHypaque,Ficoll：聚蔗糖(zhtng)，MW：40 000，高密度，低渗透压、无毒性，6Ficoll密度为1.020,Hypaque：泛影葡糖胺，34 hypaque的密度为1.200，用于调整(tiozhng)分离液的密度。,分离人外周血单个核细胞用1.0770.001的密度分离液。,第十一页，共九十五页。,3.离心分离：将细胞叠加在密度合适的分层液(1.075-1.09)上层，经离心(lxn)后细胞可分为不同的区带。,第十二页，共九十五页。,4.收集细胞5.洗涤(xd)、计数,第十三页，共九十五页。,（二）方法(fngf)评价,是分离PBMC最常用的方法操作简单(jindn)，不需特殊仪器设备分离纯度高，可达95细胞得率高，可达80,第十四页，共九十五页。,三、淋巴细胞和单核细胞的分离(fnl),（一）红细胞的去除(q ch)：低渗0.83NH4Cl处理,（二）血小板的去除(q ch)：离心洗涤；FCS,（三）单核细胞的去除 黏附去除法、羰基铁粉吞噬法,（四）Percoll离心法纯化淋巴细胞与单核细胞,第十五页，共九十五页。,单核细胞的去除(q ch),黏附去除法：根据单核细胞具有黏附作用而去除(q ch)（培养；凝胶柱）羰基铁粉法：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力（Ficoll离心；磁铁）,第十六页，共九十五页。,粘附(zhn f)贴壁法,单核细胞贴壁生长玻璃(b l)、塑料平皿/培养瓶、37、1h取未贴壁细胞-淋巴细胞（T、B）刮下贴壁细胞-纯单核细胞缺点：B细胞也有较弱贴壁，使B细胞收率,第十七页，共九十五页。,过柱吸附(xf)法,层析过柱，单核细胞滞留(zhli)于层析柱中洗脱-淋巴细胞层析柱：玻璃纤维或葡聚糖凝胶粘附能力：M、MonDC BC TC=RBC,第十八页，共九十五页。,Percoll分层液法,Percoll分层液：经聚乙烯吡咯烷酮处理过的硅胶颗粒混悬液，对细胞(xbo)无毒、无刺激。Percoll原液加PBS稀释，高速离心（21000g）连续密度梯度。,第十九页，共九十五页。,将PBMC加在分离液上低速(d s)离心后可分离PBMC中的单核细胞和淋巴细胞,第二十页，共九十五页。,淋巴细胞亚群的分离(fnl),E花环分离法尼龙棉柱分离法补体细胞毒法亲和板结合(jih)分离法免疫磁珠分离法细胞分选术,第二十一页，共九十五页。,E花环(hu hun)分离法,T细胞(xbo)（CD2/LFA2/E受体）,绵羊(minyng)红细胞SRBC,E花环,比重增加,Ficoll-Hypaque 分离液分离,低渗,第二十二页，共九十五页。,第二十三页，共九十五页。,尼龙(nlng)棉柱分离法,尼龙(nlng)棉装入5ml注射器中,加入(jir)淋巴细胞悬液,37、5 CO2、12h,RPMI 1640完全培养基灌洗,洗脱液中为T细胞,原理 B细胞可粘 附尼龙毛；T细胞不具 有粘附活性。,第二十四页，共九十五页。,方法(fngf)评价：,实验室常用分离方法之一简便、易行获得细胞纯度(chnd)较高T细胞90B细胞80尼龙毛柱法E花环法，T细胞可达99以上,第二十五页，共九十五页。,（三）补体细胞毒法原理：免疫细胞表面(biomin)的某种Ag与相应Ab结合，加入补体，借助补体介导的细胞毒作用，破坏Ag阳性的细胞，收集Ag阴性的细胞。,如：在LC悬液中加入(jir)抗人Ig抗体去除B细胞，得到T细胞。,如：在T细胞悬液中加入抗CD4抗体(kngt)去除CD4+T细胞，得到CD8+T细胞。,第二十六页，共九十五页。,亲和板分离法,第二十七页，共九十五页。,（五）免疫(miny)磁珠法,原理(yunl)：将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠（Immunomagnetic bead，IMB）,加入细胞悬液，IMB上的Ab与细胞表面的Ag反应(fnyng)，形成抗体/抗原的复合物。,外加磁场，分选出结合有免疫细胞的IMB。,第二十八页，共九十五页。,分法：直接(zhji)法间接法,第二十九页，共九十五页。,直接(zhji)法,第三十页，共九十五页。,间接(jin ji)法,第三十一页，共九十五页。,免疫磁珠法细胞(xbo)分选过程,第三十二页，共九十五页。,免疫磁珠细胞分选装置,特点:简便,快速(kui s),费用低,无需特殊设备,第三十三页，共九十五页。,全自动细胞(xbo)分选仪,第三十四页，共九十五页。,MACS法（magnetic activated cell stoter）,S,N,阴性(ynxng)选择（负选法）,主要(zhyo)组成:MACS微珠MACS分选柱MACS分选器,第三十五页，共九十五页。,第三十六页，共九十五页。,第三十七页，共九十五页。,评价(pngji),高纯度（9599）高回收率（9095）高活性（99100）效果可与流式细胞仪媲美(pmi)，但更经济、省时、简便、快速,第三十八页，共九十五页。,（六）流式细胞仪分选技术(jsh),经典方法：离心粘附(zhn f)法补体细胞毒法淘洗法免疫磁珠法,经典分离(fnl)方法的局限性 纯度 稀有细胞,？高速 高纯度 高精度,第三十九页，共九十五页。,流式细胞仪（FCM）具有(jyu)高速、高纯度、高精度优势。,激活(j hu)细胞分类仪：用来分析、鉴定细胞的流式细胞仪。Fluorescence activated cell sorter（FACS）,第四十页，共九十五页。,细胞(xbo)分选,细胞(xbo)分选（cell sorting）：有选择地从一个混合细胞群体中分离出某一类特定细胞的技术。,第四十一页，共九十五页。,488 nm laser,-,Fluorescence Activated Cell Sorting,Charged Plates,Single cells sortedinto test tubes,FALS Sensor,Fluorescence detector,第四十二页，共九十五页。,四、吞噬细胞(tn sh x bo)的分离,吞噬细胞(tn sh x bo)种类,大吞噬细胞(tn sh x bo)：单核细胞、巨噬细胞小吞噬细胞：中性粒细胞,巨噬细胞：斑蝥敷贴法、腹腔渗出分离法、中性粒细胞：右旋糖酐分离法、FicollHypaque分层液分离法,吞噬细胞分离法,第四十三页，共九十五页。,斑蟊敷贴(f ti)法分离人巨噬细胞,20世纪70年代(nindi)由我国免疫学家创立 斑蝥的酒精浸出液可趋化巨噬细胞 分离方法,第四十四页，共九十五页。,腹腔(fqing)渗出法分离腹腔(fqing)巨噬细胞,腹腔(fqing)注射诱导剂,34 days,腹腔内注射(zhsh)肝素PBS,处死动物，吸取腹腔液（含大量巨噬细胞）,洗涤细胞、计数,第四十五页，共九十五页。,3ml肝素抗凝全血1/4体积6右旋糖酐生理盐水，室温静置3040min，取上层白细胞，0.8NH4Cl溶解红细胞，离心(lxn)，取细胞沉淀用FicollHypaque分离液分离中性粒细胞和单个核细胞。,右旋糖酐法分离(fnl)中性粒细胞,第四十六页，共九十五页。,外周血中性(zhngxng)粒细胞分离(Ficoll-Hypaque),第四十七页，共九十五页。,五、细胞(xbo)活力检测,细胞活力：指细胞存活的数量，一般用百分表示。通常活力应95%方法(fngf)：苔盼蓝染色法 活细胞：不着色 死细胞：着色,第四十八页，共九十五页。,白细胞的分离(fnl)外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞和单核细胞的分离淋巴细胞亚群分离 吞噬细胞的分离,小结(xioji)：免疫细胞的分离与纯化,第四十九页，共九十五页。,第五十页，共九十五页。,第二节 淋巴细胞的数量(shling)检测,T细胞数量(shling)检测 B细胞数量的检测,第五十一页，共九十五页。,（一）根据T细胞表面CD分子检测间接荧光免疫法免疫组织(zzh)化学法：酶标、金标法微量细胞毒试验花环技术,一、T细胞数量(shling)检测,（二）根据T细胞受体检测可溶性抗原(kngyun)肽-MHC四聚体复合法 Tetramer,第五十二页，共九十五页。,1.间接荧光(ynggung)免疫法,第五十三页，共九十五页。,2.免疫(miny)组织化学法：酶标：ABC，APAAP 金标法,第五十四页，共九十五页。,3.微量细胞毒试验(shyn),针对淋巴细胞CD分子Ab与其相应的CD分子结合，借助补体依赖的细胞毒作用，可造成表达特定表面(biomin)Ag的细胞损伤，破坏膜的完整性，应用伊红染料渗入细胞内，使之着染红色，而无相应CD分子的细胞则不受损伤，因而不着色。计数着色细胞数,计算相应细胞的%。,第五十五页，共九十五页。,微量细胞毒试验(shyn),淋巴细胞,抗CD分子(fnz)单抗补体,伊红染色(rns),细胞着色,第五十六页，共九十五页。,4.花环(hu hun)技术E花环,总花环形成率（Et）：4过夜(guy)，60%80活性花环形成率（Ea）：室温低速短时离心，2040,E受体:CD2，表达(biod)于T细 胞、胸腺细胞、NK细胞,T cell,第五十七页，共九十五页。,SPA-IgG（anti-CD）-CD分子(fnz)-T细胞亚群,4.花环技术(jsh)葡萄球菌花环法,4.花环技术(jsh)抗体致敏细胞花环法,SRBC-anti-CD-T细胞（CD分子）,第五十八页，共九十五页。,(三)可溶性抗原(kngyun)肽-MHC四聚体复合物法,是一项近年发展起来(q li)的新技术与FCM联合,定量检测抗原特异性T淋巴细胞,第五十九页，共九十五页。,第六十页，共九十五页。,1.mIg的检测:酶免疫法、荧光免疫法2.CD抗原检测 酶免疫组织化学法 间接(jin ji)荧光免疫法 流式细胞术3.受体检测（FcR、CR）EA花环 EAC花