2022年医学专题—土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课)...ppt

课题2土壤中分解(fnji)尿素的细菌的分离与计数,专题(zhunt)2微生物的培养与应用,第一页，共五十一页。,一、课题(kt)背景,1、尿素(nio s)的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能(cinng)被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,第二页，共五十一页。,3、常见(chn jin)的分解尿素的微生物,芽孢(y bo)杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌。,4、课题(kt)目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,第三页，共五十一页。,1、实例(shl)：,启示(qsh)：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。,原因：因为热泉(r qun)温度70800C，淘汰了绝大多 数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,第四页，共五十一页。,要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；方法：抑制大多数微生物不能生长造成有利于该菌生长的环境结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板(pngbn)稀释等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选(shixun)原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括(boku)营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,第五页，共五十一页。,3、土壤中分解尿素的细菌(xjn)的分离与计数所需培养基：,从物理性质(wl xngzh)看此培养基属于哪类？,固体(gt)培养基,第六页，共五十一页。,在此培养基中哪些(nxi)作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素(nio s)氮源：尿素(nio s),思考2该培养基对微生物（具有，不具有）选择作用。如果(rgu)具有，其选择机制是。,具有,只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长,第七页，共五十一页。,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制(yzh)，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,4、培养基选择分解尿素(nio s)的微生物的原理,第八页，共五十一页。,1、显微镜直接(zhji)计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算(j sun)一定容积里样品中微生物的数量。,（二）.统计菌落(jnlu)数目：,不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,第九页，共五十一页。,（比例(bl)计数法）,待测样品(yngpn),等量(dn lin)的已知含量的红细胞,混匀,涂抹,测定：,计算单位体积内的细菌数目,将含已知数目的红细胞液体与待测的菌液按1：1均匀混合，在显微镜下数出各自的数目，然后求菌液中的细胞数目。,【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。,第十页，共五十一页。,举例：已知红细胞浓度(nngd)为M个/mL，从体积为N mL的大肠杆菌培养液中取出大杆菌液与红细胞液等量均匀混合后，涂片，染色，镜检。在同一视野中发出有红细胞W个，大肠杆菌Y个，求NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X是多少？,观察(gunch)到的红细胞平均数/观察(gunch)到的细菌平均数红细胞含量/细菌含量,公 式,第十一页，共五十一页。,2.间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落(jnlu)是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落(jnlu)代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表(dibio)某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表(dibio)涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表(dibio)稀释倍数。,第十二页，共五十一页。,注意事项为了保证(bozhng)结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。,第十三页，共五十一页。,如何从平板上的菌落数推测(tuc)出每克样品中的菌落数？,统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好(zu ho)能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算,教材(jioci)P22,第十四页，共五十一页。,计数法,直接(zhji)计数法、平板计数法、比浊法、膜过滤法,第十五页，共五十一页。,实例(shl)分析P22,你认为哪个同学的结果更接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果(rgu)需要，如何改进？,第十六页，共五十一页。,实例(shl)分析P22,第一同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有(jyu)说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是其中1个平板的计数结果与2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。,第十七页，共五十一页。,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试(csh)因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,（三）.设置(shzh)对照：,实例(shl)：教材P23,原因：土样不同，培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),第十八页，共五十一页。,小结：通过这个事例可以(ky)看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案(fng n)一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行(jnxng)培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,第十九页，共五十一页。,根据图示27填写以下(yxi)实验流程：,试验(shyn)设计：,第二十页，共五十一页。,实验的具体操作.土壤取样 从肥沃(fiw)、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,第二十一页，共五十一页。,准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择(xunz)培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。,第二十二页，共五十一页。,应在火焰(huyn)旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释(xsh)度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,三样品(yngpn)的稀释,第二十三页，共五十一页。,由于初次(ch c)实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。,第二十四页，共五十一页。,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤(trng)中细菌的总量和测定土壤(trng)中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择(xunz)培养的条件。,第二十五页，共五十一页。,.取样(qyng)涂布,实验时要对培养(piyng)皿作好标记。注明培养(piyng)基类型、培养(piyng)时间、稀释度、培养(piyng)物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数(bish)的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,第二十六页，共五十一页。,.微生物的培养与观察(gunch)并计数,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止 因培养时间不足(bz)而导致遗漏菌落的数目。,培养(piyng)不同微生物往往需要不同培养(piyng)温度。细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,第二十七页，共五十一页。,当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300的平板(pngbn)进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板(pngbn)进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板(pngbn)所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。,第二十八页，共五十一页。,微生物的培养(piyng)与观察,第二十九页，共五十一页。,第三十页，共五十一页。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌(xjn)的重要手段。,第三十一页，共五十一页。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分(qfn)细菌的重要手段。,第三十二页，共五十一页。,关注(gunzh)菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,第三十三页，共五十一页。,关注(gunzh)菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,第三十四页，共五十一页。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色(yns)、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,第三十五页，共五十一页。,思考在研究未知微生物时务必规范(gufn)操作，以防被致病微生物感染，实验后一定要洗手。,第三十六页，共五十一页。,（六）鉴定：筛选后必鉴定 鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存1、酚红培养基：鉴定分解(fnji)尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红脲酶阳性2、伊红美蓝培养基：鉴定大肠杆菌。原理：代谢产物与伊红美蓝结合 菌落呈深紫色并带有金属光泽。,第三十七页，共五十一页。,伊红美蓝培养基是鉴别培养基，可以(ky)用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的代谢产物与伊红美蓝结合，使菌落呈深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。,例如：鉴别(jinbi)大肠杆菌培养基,第三十八页，共五十一页。,大肠杆菌(d chn n jn)呈 黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌(d chn n jn)在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,第三十九页，共五十一页。,三、操作(cozu)提示,无菌操作(cozu),做好标记(bioj),制定计划,第四十页，共五十一页。,课题成果(chnggu)与评价,（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择(xunz)培养基是否筛选出菌落,对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选(shixun)出一些菌落。,第四十一页，共五十一页。,如果学生选取的是同一种土样，统计的结果(ji gu)应该接近。如果结果(ji gu)相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。,