孔雀球虫的分子鉴定及其ITS_rRNA基因序列分析_张誉方.pdf

动物医学进展，（）：孔雀球虫的分子鉴定及其 基因序列分析收稿日期：基金项 目：云 南 省 朱 兴 全 专 家 工 作 站 项 目（）；云 南 农 业 大 学 兽 医 公 共 卫 生 省 创 新 团 队 项 目（）作者简介：张誉方（），女，山东烟台人，硕士研究生，主要从事人畜共患兽医寄生虫病研究。刘永张（），男（土家族），云南大姚人，兽医师，本科，主要从事野生动物的疾病防治工作。同等贡献作者。通讯作者张誉方，刘永张，贺君君，邹丰才，杨建发（云南农业大学动物医学院，云南昆明 ；云南省昆明动物园，云南昆明 ）摘要：为了解云南省昆明市孔雀感染球虫的种类及种属关系，采集昆明市个动物园孔雀粪便样品及肠道内容物样本进行球虫卵囊的收集，进行形态学鉴定，扩增球虫 基因，测序和序列分析，并利用 软件构建遗传系统进化树。结果显示，扩增的 基因序列长度为 和 ，共鉴定出种球虫，分别为和缓艾美耳球虫（）和火鸡和缓艾美耳球虫（.），相似度均为 ；进化分析结果表明，孔雀和火鸡之间可能存在球虫的交叉感染风险。该研究结果丰富了野生雉类寄生虫病的资料。关键词：孔雀；球虫；基因；基因序列分析中图分类号：；文献标识码：文章编号：（）云南省作为生物多样性宝库和西南生态安全屏障，依靠其独特的地理位置与气候特点，成为了动植物生存繁衍的自然天堂。孔雀作为云南的名片，同时也是云南的“形象代言人”。在孔雀的种群中，绿孔雀被列为世界自然保护联盟濒危物种，是我国国家级重点保护野生动物，也是中国传统文化中具有重要代表意义的物种；而蓝孔雀作为特种经济动物，其和白孔雀的观赏价值居于前列，相比于绿孔雀，它们具有良好的食用价值和药用价值。球虫对许多宿主有严重危害，能引起家畜、家禽、野生动物甚至人体的球虫病，可导致宿主生产性能降低，幼体因感染球虫而大量死亡，从而造成极大的经济损失。孔雀作为球虫的易感宿主，其球虫病是由艾美耳属或等孢属球虫感染所引起的一种原虫病。由于不科学的饲养管理，饲养场所被球虫卵囊污染，使孔雀患上球虫病，致使其生长受阻、贫血；幼龄孔雀感染球虫多因抵抗力低下而造成死亡，从而威胁孔雀的种群数量和种群健康。本研究对来自昆明市个动物园的孔雀粪样及其肠道内容物分离获得的球虫卵囊进行形态学观察、基因组 的提取和基于内转录间隔区（，）基因序列的聚合酶链反应（，）进行扩增，分析其基因序列并鉴定其种属。以期能够拓展目前对孔雀球虫种类的认识，有利于园区对患球虫病孔雀针对性用药并制定科学合理的防治方案，促进濒危动物和生物多样性保护。材料与方法材料样品来源孔雀粪样及肠道内容物采自昆明市个动物园，用自封袋分装，逐一对应编号登记，置于低温保存。主要试剂无水乙醇、琼脂糖粉、双蒸水、缓冲液、缓冲液、粪便 提取试剂盒，天根生物科技（北京）有限公司产品；核酸染料（全 式 金），丰 科 生 物 科 技 有 限 公 司 产 品；、（）、酶、标准 、，宝生物工程（大连）有限公司产品。主要仪器设备 仪（），公司产品；凝胶成像系统（），大韩科学仪器有限公司产品；高速台式离心机（），公 司 产 品；电 子 分 析 天 平（型），德国赛多利斯公司产品；旋涡混合器（），江苏海门市麒麟医用仪器厂产品；恒温水浴箱（），深华生物技术有限公司产品；瞬时迷你离心机（），湘仪离心机仪器有DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.06.018限公司产品。方法样品预处理对孔雀粪样及肠道内容物进行预处理，包括球虫的分离和纯化，具体操作参考陈培培等的方法。形态学观察将收集到的孔雀球虫卵囊液用磷酸缓冲盐溶液（，）清洗次，用移液器吸取少量卵囊液至载玻片，放置于光学显微镜下镜检。将观察到的球虫卵囊进行测量并拍照。球虫卵囊的形态学特征为卵囊呈球形或亚球形，囊壁分内外层，可能有卵膜孔，孢子化卵囊内有个孢子囊，每个孢子囊内含有个子孢子。卵囊和孢子囊内分别由卵囊残体和孢子囊残体。基因组 提取及 扩增取少量卵囊液，用双蒸水反复冲洗次后，分别置于离心管中，编号为，参考基因组 提取试剂盒说明书提取球虫基因组，样品置 于 冰箱保存备用。参考李清月等扩增艾美耳球虫属 基因的引物，扩增球虫的 基因，上游 引 物：（）和 下 游 引 物：（），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应扩增体系在 下进行，包括 （），（），（），上、下游引物（）各，聚合酶，模板 和灭菌双蒸水。扩增程序为：预变性 ；，共 个循环；最后 延伸 ，结束反应，同时设阴 性 对 照。取 产 物 进 行 琼脂糖凝胶电泳，用 核酸染料染色，紫外投射仪下观察结果，凝胶成像系统摄像。基因部分序列测定及系统进化树构建将阳性 产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序，测序结果进行拼接，并于 进行 在线比对分析。利用 软件构建进化树（），以兔隐孢子虫（）作为外群，方法为邻接法（），置信值重复抽样 次。结果形态学观察未孢子化的孔雀球虫卵囊呈 卵 圆 形，大小为 ，卵壁光滑，有卵囊残体，无极帽。孢子化卵囊呈卵圆形，大小为 ，孢子囊呈椭圆形，大小为 ，有孢子囊残体（图）。球虫未孢子化卵囊（）；球虫孢子化卵囊（）（）；（）图球虫卵囊的显微镜下观察 扩增结果经 扩增，份样品成功扩增出长度为 、的基因片段，且无非特异性条带，空白对照为阴性（图）。标准 ；阴性对照；样品 ；图球虫 基因的 扩增 基因部分序列测定及系统发育分析测序结果显示，扩增获得的 份孔雀球虫的 基因序列片段长度分别为 、；比对结果显示，号样品与火鸡和缓艾美耳球虫（）相似度为 ，剩余样品与和缓艾美耳球虫（.）相似度为 。利用 软件，用相邻法构建种系发育进化树（图）。结果显示，本研究的号球虫分离株与 中检索到的登录号为 的火鸡和缓艾美耳球虫（.）分离株并入同一分支，表明这个样品分离株与来自英国的火鸡体内分离出的虫株亲缘关系较近；而号球虫样品分离株与登录号为 的鸡孔雀艾美动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）耳球虫（.）分离株并入同一分支，表明该样品分离株与来自捷克共和国的火鸡体内分离的虫株亲缘关系较近；同时，个样品与登录号为 来自美国肉鸡体内分离的和缓艾美耳球虫（.）和 自英国火鸡体内分离的分散艾美耳球虫（.）汇在同一个大的分支，而来自于葡萄牙山羊体内分离的阿氏艾美耳球虫（.）则单独形成一个分支。图基于 基因构建的球虫种系发育进化树 讨论孔雀球虫病多发于夏季，温暖潮湿的气候有利于球虫卵囊的繁殖生长。幼龄孔雀主要集中在舍饲区饲养，其低下的免疫力和地面平养等不科学的饲养管理均为寄生虫的寄生创造了有利条件；成年孔雀活动范围多在对游客开放的散养区，粪便不及时清理、潮湿的生活环境容易使其误食球虫卵囊从而被感染，进而导致球虫病的发生和传播扩散。由于采集动物粪便样本或直接获得死亡动物尸体较为方便，因此，国内外对于园养和野生动物保护机构的孔雀寄生虫调查相对较多。何牧等总结了国内外发现的孔雀原虫，包括种艾美耳球虫和种等孢球虫；王荣琼等对昆明动物园孔雀消化道寄生虫进行调查发现艾美耳球虫感染非常严重，幼龄孔雀死亡率高达；等 对沙特阿拉伯中部地区某农场绿孔雀进行寄生虫调查同样发现球虫感染严重；等 对密歇根州家动物园的散养孔雀粪便进行检测发现了大量的球虫卵囊；等 对巴西圣保罗动物园的 份圈养孔雀粪样进行检测发现球虫卵囊阳性 份，球虫感染率高达。以上数据均说明孔雀较容易感染球虫。但目前国内外针对孔雀球虫感染的调查研究大多局限在流行病学调查及病例诊治，且研究结果存在一定的局限性，少有深入分子生物学层面等研究。本研究中自孔雀粪样中检出了火鸡和缓艾美耳球虫，进化树结果显示，其与自火鸡体内检出的火鸡和缓艾美耳球虫亲缘关系很近，表明孔雀和火鸡之间有可能存在球虫的交叉感染，但火鸡和缓艾美耳球虫是否能够感染除孔雀、火鸡以外的其他雉科动物有待进一步研究。此外，本研究虽未检出孔雀有等孢属球虫的感染，但有学者研究结果表明，孔雀可以感染等孢属球虫，而等孢属球虫作为人兽共患寄生虫，孔雀通过人工养殖或动物园观赏而与其他动物或人产生的密切接触可能引发等孢属球虫的感染风险，对人类健康及公共卫生安全有着严重的负面影响，故不能轻视。云南作为孔雀之乡，应当引起对孔雀种群保护的足够重视，加大孔雀寄生虫病防治力度，其舍饲区和散养区要进行定期消毒，必要时采用火焰消毒；建议采用地面网架式兼食盆饲喂的养殖方式，粪便要及时进行清理，保证圈舍的干燥和洁净；同时加强饲养管理水平，密切关注孔雀的健康状态，定期驱虫。以期进一步有效促进濒危动物及生物多样性保护，努力维护自然生态平衡 和公共卫生安全。参考文献：顾伯健，王放野生绿孔雀生态学及保护生物学研究进展生物多样性，（）：何牧，左仰贤孔雀球虫种类研究历史及概况云南大学学报（自然科学版），（）：闫大任蓝孔雀球虫病的发病特点及综合防控措施畜牧与饲料科学，（）：陈培培，矫海婷，慕阳，等三种鸡艾美耳球虫虫株的分离及鉴定黑龙江畜牧兽医，（）：，李国清 兽医寄生虫病学 北京：中国农业大学出版社，：李清月，龚治忠，刘刚种雁艾美尔球虫 序列测定与系统发育分析 阜阳师范大学学报（自然科学版），（）：丛培强，徐晓东，吕艳艳 蓝孔雀球虫病的诊治体会 特种经济动植物，（）：王荣琼，刘永张，李树荣，等 昆明动物园孔雀消化道寄生虫调查动物医学进展，（）：王荣琼，刘永张，邹丰才，等 孔雀嗉囊毛细线虫的分子鉴定张誉方等：孔雀球虫的分子鉴定及其 基因序列分析动物医学进展，（）：猫膀胱结石合并胰腺炎的诊治江佳丽，卢学坚，杨宁宇，纪璇，周光现，林红英，陈进军，康丹菊（广东海洋大学滨海农业学院，广东湛江 ；泰洋动物医院，广东广州 ）摘要：笔者通过临床表现、血液学检查及影像学检查确诊例猫膀胱结石合并胰腺炎的病例；施以膀胱切开术治疗，配合补液疗法，辅以恩诺沙星、托芬那酸注射液、乌司他丁和奥曲肽等药物治疗，成功治愈，供业界同仁交流。关键词：膀胱结石；胰腺炎；药物控制；手术治疗中图分类号：；文献标识码：文章编号：（）膀胱结石（）是存在膀胱内的结石刺激膀胱壁引起尿血、尿频、尿淋漓、尿闭等排尿异常的一种疾病，包括原发性和继发性两种。膀胱结石是尿石症中早期症状最不明显的一种，若诊治不及时，往往会随着病程的延长危及动物生命，且复发率高，经过数十年的研究仍无有效的方法来防止结石的形成或通过特定药物来溶解结石。原发性膀胱结石形成的确切病因尚未可知，目前认为可能与动物性别、品种、饮食、环境、生活习惯、细菌感染和自身泌尿系统机能等有关，且存在性别和品种易收稿日期：基金项目：年广东省一流专业动物医学（）；动物医学专业认证（）作者简介：江佳丽（），女，广东揭阳人，动物医学本科生。通讯作者养殖与饲料，（）：，（：）（），（）：，（），（）：，（），；（）：王荣琼，袁飞洲，吕瑞青，等紫茎泽兰液对孔雀球虫活性的影响 云南农业大学学报（自然科学），（）：董壮，李秀云，关春宇，等幼龄蓝孔雀组织滴虫与球虫混合感染的诊断报告野生动物学报，（）：唐尕让，范玉玲新时期野生动物资源的保护及持续利用探究现代农业研究，（）：，（.，；.，）：，.，；：；