蕨藻红素标准样品的研制_邓建朝.pdf

第 32 卷，第3 期2023 年3 月化学分析计量CHEMICAL ANALYSIS AND METERAGEVol.32,No.3Mar.2023蕨藻红素标准样品的研制邓建朝1，2，荣辉1，2，刘洋帆1，3，戚勃1，2，胡晓1，2，陈胜军1，2，杨贤庆1，2，李来好1，2（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广州510300；2.大连工业大学，海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁大连116034；3.上海海洋大学，食品学院，上海201306）摘要建立了蕨藻红素标准样品的研制方法。以总状蕨藻为原料，采用C18层析的方法，制备蕨藻红素单体，通过紫外吸收光谱、红外光谱、质谱和核磁共振等技术手段进行结构确证与表征。标准样品采用高效液相色谱法进行了均匀性、稳定性检验和8家实验室联合定值。结果表明，该样品在95%的置信区间范围均匀性良好；在25 条件下可储存6天，在4 条件下可储存24个月，稳定性良好；定值结果确定其纯度为98.64%，置信度95%的扩展不确定度为0.44%。该标准样品达到了GB/T 15000.32008规定的技术要求，具有溯源性，可用于含有蕨藻红素相关产品的质量控制和含量分析。关键词蕨藻红素；标准样品；均匀性；稳定性；定值；不确定度中图分类号：O652 文献标识码：A 文章编号：1008-6145(2023)03-0006-06Preparation of certified reference materials of CaulerpinDENG Jianchao1,2,RONG Hui1,2,LIU Yangfan1,3,QI Bo1,2,HU Xiao1,2,CHEN Shengjun1,2,YANG Xianqing1,2,LI Laihao1,2(1.Key Laboratory of Aquatic Product Processing，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou510300，China；2.Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing，Dalian Polytechnic University，Dalian116034，China；3.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China)Abstract A method for preparation of the certified reference material(CRM)of Caulerpin was established.Caulerpin was obtained by means of silica gel chromatography from Caulerpa racemesa.The structure of Caulerpin was characterized by using ultraviolet-spectroscopy,infrared spectroscopy,mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy.Caulerpin sample was investigated by homogeneity test,stability test,and cooperative certification by eight laboratories.The results indicated that the homogeneity of Caulerpin was excellent in confidence coefficient of 95%,with good stability within 6 days at 25 and 24 months at 4.The certified value of the reference material of Caulerpin was 98.64%with the expanded uncertainty of 0.44%in confidence coefficient of 95%.It was conformed to the technical requirement of GB/T 15000.32008 and could be traceable of Caulerpin could be used in the content determination and testing method validation of Caulerpin related products.Keywords Caulerpin;certified reference material;homogeneity;stability;certification;uncertainty蕨藻红素是从蕨藻属海藻中得到的一种次生代谢物质。蕨藻红素分子化学式为C24H18N2O4，该物质为橙红色，属于单斜晶系，空间群为Cc，为非晶体学 C2对称性的吲哚生物碱物质1。相关文献2-5报道，蕨藻红素是蕨藻等天然产物的主要活性成分，具有促进或抑制植物生长，延缓果实成熟、花朵衰老等作用，广泛应用于脱叶剂、除草剂，并且蕨藻红素具有良好的抗肿瘤、抗病毒等活性。doi:10.3969/j.issn.1008-6145.2023.03.002基金项目现代农业产业技术体系建设专项（CARS-50）；中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2019TS02）；广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项（2023KJ151）通信作者陈胜军，博士，研究员，主要从事水产品加工与质量安全工作收稿日期20220118引用格式邓建朝，荣辉，刘洋帆，等.蕨藻红素标准样品的研制 J.化学分析计量，2023，32（3）：6.DENG Jianchao,RONG Hui,LIU Yangfan,et al.Preparation of certified reference materials of CaulerpinJ.Chemical Analysis and Meterage,2023,32(3):6.6邓建朝，等：蕨藻红素标准样品的研制目前国内还没有能够准确分析蕨藻红素含量的标准物质，使得相关蕨藻红素的深入研究和开发受到很大限制。常用的样品提取方法包括索氏提取法6、热回流提取法7、超声波提取法8和微波辅助提取法9等，笔者采用微波辅助提取蕨藻可以缩短提取时间，提高提取效率，实现样品的快速制备。标准样品分离手段常见方法有层析法10、制备液相色谱11、高速逆流色谱12等分离手段。制备液相色谱进样量较小，色谱柱容易受到污染，限制了标准样品的放大制备。高速逆流色谱对于粗提取物的分离纯化有一定优势，但是由于蕨藻粗提物中含糖类杂质较多，粘度较大，进样后体系平衡影响较大，限制了蕨藻红素的制备。笔者采用层析法有助于放大制备标准样品，使用流动相体系为甲醇-水，体系优化相对比较方便。对于一次制备的标准样品，通过二次分离纯化，进一步除去微量杂质。按照 GB/T 15000.32008 标准样品工作导则8，通过层析法研制了蕨藻红素标准样品，为蕨藻红素相关产品的质量控制和含量分析提供了保障。1实验部分1.1主要仪器与试剂总状蕨藻：从广东省湛江市海边采集，晒干后密封保存。高速万能粉碎机：FW135型，天津市泰斯特仪器有限公司。常压微波辅助合成/萃取仪：MAS-型，上海新仪微波化学科技有限公司。高压柱塞泵：LP0110型，上海三为科学仪器有限公司。紫外检测仪：HD-3型，上海青浦沪西仪器厂。中高压色谱柱：(1)MP-2503型，柱内径26 mm，柱长460 mm；(2)MP-2502型，柱内径26 mm，柱长920 mm，上海三为科学仪器有限公司。旋转蒸发仪：EYELA-1000型，上海亚荣生化仪器厂。多管路自动平衡离心机：TDZS-WS型，湖南湘仪离心机仪器有限公司。液相色谱仪：(1)Agilent1100型，美国安捷伦科技有限公司；(2)LC-20A型，日本岛津公司。超高效液相色谱-串联质谱仪：Xevo 系列，ACQUITY型，美国沃特世公司。红外光谱仪：IR Affinity-1型，岛津(中国)有限公司。超导脉冲傅里叶变换核磁共振波谱仪：Bruker AVANCE HD 500型，德国布鲁克仪器有限公司。卡尔费休库仑法水分测定仪：915 Ti-touch 型，瑞士万通公司。电感耦合等离子体质谱仪：Agilent 7800型，安捷伦科技(中国)有限公司。甲醇、乙醇：色谱纯，广州化学试剂厂。实验用水为一级水。1.2实验步骤1.2.1蕨藻红素粗提取采用微波辅助提取14-15蕨藻红素。将干燥的总状蕨藻粉碎，用80%(体积分数，下同)的乙醇作为提取溶剂，每次将粉碎样品根据物料溶剂比1 20(1 g物料添加20 mL溶剂)，在60、800 W的微波条件下提取25 min，每个样品提取2次，提取液经减压抽滤后，通过旋转蒸发仪浓缩，得到蕨藻红素粗提物，置于冰箱中在4 保存备用，后续用柱层析进行分离纯化制备。1.2.2层析柱分离利用MP-2502型中高压层析柱以C18为填料进行分离，甲醇-水(体积比为80 20)为流动相，等度洗脱，流量为10 mL/min，紫外检测器波长设置为254 nm，收集含蕨藻红素组分，色谱图如图1所示。收集合并相同组分，减压浓缩，冷冻干燥，得到高纯度蕨藻红素单体。1.2.3蕨藻红素层析液二次柱层析纯化收集一次层析液，浓缩至约20 mL，采用80%甲醇为流动相等度洗脱，流量为10 mL/min，利用MP-2503型层析柱进行二次柱层析。收集的蕨藻红素二次层析液利用高效液相色谱法进行纯度测定。结果表明，二次柱层析分离制备后，蕨藻红素用高效液相色谱面积归一法测试，纯度达到98.36%。1.2.4重结晶将二次纯化的蕨藻红素样品通过色谱纯甲醇溶解，低温冷却，析出晶体，离心，弃上清液，晶体重结晶，干燥。结果表明，采用面积归一法定量，色谱峰01020t/min4050607030蕨藻红素图1蕨藻层析色谱图7化学分析计量2023 年，第 32卷，第 3 期总面积扣除杂质色谱峰后计算得蕨藻红素纯度为99.30%。蕨藻红素液相色谱图如图2所示。1.2.5纯度分析(1)高效液相色谱法纯度分析。色谱条件：C18色谱柱(250 mm4.6 mm，5 m，美国安捷伦科技有限公司)；流动相为甲醇-水(体积比为80 20)，等度洗脱，流量为1.0 mL/min；运行时间为50 min；色谱柱温度为30；检测波长为220 nm。(2)液相色谱-质谱法纯度分析。色谱条件：色谱柱为 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(50 mm2.1 mm，1.7 m，美国沃特世公司)；流动相为甲醇-水(体积比为80 20)，等度洗脱，流量为0.2 mL/min；柱温为40；进样体积为5 L；运行时间为5 min。质谱条件：毛细管电压为2.5 kV；锥孔气流量为150 L/h；脱溶剂温度为 500；质量扫描范围为1001 000 Da。1.2.6杂质分析(1)水分分析。将样品于105 烘箱中干燥4 h后，采用卡尔费休库仑滴定直接进样法对样品进行水分的测定。每次称取10.0 mg，三次测定，取平均值。(2)无机元素分析。利用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定等无机元素的含量。参考文献16的测定方法，将样品配成为200 g/mL的甲醇溶液。用校准