连续静置培养促进大肠杆菌生长和运动_王媛.pdf

第 卷 第期 年月合 肥 工 业 大 学 学 报（自 然 科 学 版）（）收稿日期：；修回日期：基金项目：国家自然科学基金资助项目（）；安徽省自然科学基金资助项目（）作者简介：王媛（），女，山东临沂人，合肥工业大学硕士生；王芳彬（），男，安徽芜湖人，博士，合肥工业大学副教授，硕士生导师，通信作者，：连续静置培养促进大肠杆菌生长和运动王媛，王芳彬（合肥工业大学 食品与生物工程学院，安徽 合肥 ）摘要：大肠杆菌繁殖速度快、基因结构简单，已构建出黏性鞭毛的突变体，是一种研究鞭毛运动的模式生物。大肠杆菌能对外界环境的变化做出响应，是其赖以生存的基础，其中很重要的就是其生长和运动行为的变化。为了研究连续营养作用下的大肠杆菌生长和运动的情况，文章采用连续静置液体培养大肠杆菌，通过定期检测菌液 值的方法获得大肠杆菌的生长曲线，发现大肠杆菌生长到达稳定期的时间随培养天数增加而缩短；观察连续静置液体培养的大肠杆菌在稳定期的形态变化，发现大肠杆菌的形态并不受生长和运动的影响。利用倒置显微镜结合乳胶小球标记鞭毛技术观察大肠杆菌在稳定期的鞭毛马达的转动过程，发现随着培养天数的增加，大肠杆菌鞭毛马达的转速加快，说明连续营养培养会促进大肠杆菌鞭毛马达的运动性；后续的群体运动实验进一步验证了该结论。在该基础上，研究发现大肠杆菌运动能力的实现需要相关的基因，包括 和 。该文为发现营养在大肠杆菌生长运动中的作用提供了相关的科学依据，为深入研究大肠杆菌的鞭毛运动与肠道营养之间的关系提供了潜在的途径。关键词：大肠杆菌；鞭毛；生长；运动；形态中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，）：，.，.，.，.，.，.，；，.，.，.：；引言运动性是细菌在环境中移动的一种高效策略，这一过程对于细菌在营养缺乏的条件下生存至关重要。文 献 研 究 了 大 肠 杆 菌 （一种肠道共生菌株的模式生物）在连续培养下的生长动力学，该菌株在体外模拟人类肠道内细菌有 规 律 的 营 养 供 应。研 究 表 明 大 肠 杆 菌 在 培养基中连续培养，每 中到达稳定期的时间缩短，生长速度加快，最终导致稳定期和指数期蛋白表达上存在差异，这些蛋白质可能会影响鞭毛运动的能力。迄今为止，大多数将营养与微生物群联系起来的研究都集中在细菌的生长上，但是关于营养诱导的细菌生长影响其鞭毛运动的研究却很少。在大肠杆菌中，鞭毛马达是一种跨膜蛋白，可以推动细菌在液体介质中游动。马达旋转由多达 个彼此独立工作的定子驱动，每个定子由个单位的 蛋白和个 蛋白组成，它的运动方式有种，即在前进和原地打转之间交替。当大肠杆菌上的所有鞭毛马达沿逆时针（，）方向旋转时，细菌就会前进；而当一个或多个马达沿顺时针（，）方向旋转时，细菌会原地打转。本文以.作为模式 生物进行研究，对.连续静置 培养，通过紫外分光光度计定时检测.的 生 长 状 况 得 到 了.连续的生长曲线，并通过乳胶小球粘附在鞭毛马达上，利用倒置显微镜 连续观察.稳定期的有效运动的变化，本文在此运动的基础上研究了在连续静置培养下处于稳定期的.的泳动性的变化，并且与另外种 野 生 型 菌 株.（）和.（）的泳动性 作比较，.的运动性强意味着泳动性比较敏感。同时本文研究了在连续静置培养下对处于稳定期的.形态的影响。这些生 物 物 理 学 实 验 对 深 入 了 解.马达的运动机制及生物学功能的研究具有一定的作用。材料与方法实验材料实验菌株.、.（）和.（）均由中国科技大学袁军华实验室提供。实验试剂 、（公司）；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、无水乙醇、盐酸、甘油、过氧化氢（国药集团化学试剂有限公司）；天冬氨酸（天津市东丽区天大化学试剂厂）；（）；蛋氨酸、乳酸、乙二胺四乙酸（）、氯化钠、多聚赖氨酸、三磷酸腺苷标准品、磷酸酶抑制剂（美国 公司）；氯霉素（）。实验仪器与设备 超净工作台（上海智诚）；分光光度计、离心机（）；手提式高压蒸汽灭菌器（上海申安）；超声波破碎仪（新 芝 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司）；摇 床（）；计（济南前程分析仪器有限公司）；超纯水净化系统（上海和泰仪器有限公司）；高精密电子天平（公司）；恒温培养箱（上海海向仪器设备厂）；倒置显微镜（）；荧光成像系统（）。生长曲线的测定准备 个 的离心管，分成组置于离心管架上。配 培养基，调节 值到左右，然后分装到 离心管中，分别加入个 离心管盛有 培养基，个 离心管分别盛有、培养基，个 离心管盛有 培养基。第天首先将分装好灭过菌的 培养基置于超净台中，从过夜培养细菌的试管中取出 的菌液，加入到 液体培养基中，摇匀以后放在离心管架上，然后放进 恒温箱里，每隔测第期王媛，等：连续静置培养促进大肠杆菌生长和运动 值，内测次 值，最后一次测完立马离心，、下离心后倒入新的 培 养 基 中。过 夜 培 养 后，第天早上立马离心，、，然后每隔测 值，第天大概需要稀释测 值，取 菌液加 空培养基放进离心管内，震荡均匀后转入比色皿里测 值，连续 中每隔测次，需要迅速测 值，后离心倒掉上清，加入 液体培养基继续培养。第天早上，经过培养 后再离心，、，然后加入新鲜 培养基，开始每隔 测次，取 菌液加 空培养基放进离心管内，震荡均匀后转入比色皿里去测 值，等菌液浓度稳定以后每隔测次即可。后离心倒掉上清，加入 空培养基继续培养。第 天 早 上，经 过 培 养 后 再 离 心，、，然后加入新鲜 培养基，开始每隔 测次，取 菌液加 空培养基放进离心管内，震荡均匀后转入比色皿里去测 值，等菌液浓度稳定以后每隔测次。后离心倒掉上清，加入 空培养基继续培养。第天早上，经 过 培 养 后 再 离 心，、，然后加入新鲜 培养基，开始每隔 测次，取 菌液加 空培养基放进离心管内，震荡均匀后转入比色皿里测 值，等菌液浓度稳定后每隔测次。运动性实验在连续静置培养.的生长过程中，每天离心后，将新鲜的 培养基倒入，并在后进入稳定期。然后取出细菌溶液，并将该细菌溶液稀释其 值为 。取 溶液洗涤细菌，离心 ，将上清液除去，加入 溶液，然后重悬。用移液管取出 细菌溶液，用 号针头将其吸进注射器。然后用聚苯乙烯软管连接注射器，将这个注射器来回挤压 次。使用小口径的针头切去长的细菌鞭毛，从而缩短鞭毛，并使乳胶球更容易粘在鞭毛上。接下来，需要将鞭毛细菌溶液离心至 ，离心 ，除去上清液。最后吸取 溶液移到 离心管中，并将其与剩余细菌混合，以使细菌均匀地悬浮在 溶液中。用移液枪取出 的聚赖氨酸溶液，将其缓慢且均匀地放在干燥的盖玻片上，持续 。将双面胶带切成段等长，然后粘贴到载玻片上。双面胶带的个部分之间的距离短于盖玻片的长度。用镊子夹住盖玻片的一个角，然后用纯净水清洗盖玻片。从盖玻片上除去多余的聚赖氨酸，自然干燥，然后将盖玻片粘到处理过的一侧。在此实验中，使用移液器将 细菌悬液吸入切片通道，然后将准备好的切片倒置 。这样可以使盖玻片位于下方，而载玻片位于上方。让细菌与聚赖氨酸溶液充分接触，以便细菌可以粘在盖玻片上观察.的运动。后，用移液管吸取 溶液，并通过切片通道缓慢洗涤，以去除未粘在盖玻片上的.。缓慢加入 乳胶颗粒，倒置 。然后用移液器吸取 溶液，并通过切片通道缓慢洗涤，以洗去未粘附在.鞭毛上的乳胶小球。最后用 的 型油脂（润滑脂）密封型材通道的两端，以备实验。使用 相机（）倍物镜并且以 帧的速度记录.鞭毛马达的运动。所有实验均在 下进行。游动性实验首先将配好的 培养基平放在超净台上，然后在连续静置培养大肠杆菌的生长过程中，每天早上离心后倒入新鲜的 培养基等左右到达稳定期，再取出菌液，稀释菌液使其 值为 。继续取出菌液滴在培养皿的中心位置，吹风左右，直到菌液在培养基表面晾干为止。最后轻轻地放置在 恒温箱中孵育，倒置培养，孵育 以后将培养皿轻轻地放在凝胶成像仪中拍照。形态实验测定用乙 醇 清 洗 片 长 宽 为 的载玻片，然后用纯水清洗 片长宽为 的盖玻片，最后自然晾干，准备后续实验。使用移液枪吸取 的 公司的多聚赖氨酸（）溶液，缓慢且均匀地涂布在已经晾干的盖玻片上，静置 。然后将双面胶截成段一样长且等长于盖玻片粘于载玻片上，段双面胶的间距要小于盖玻片的长度。用镊子夹住盖玻片的一角，再用纯水清洗盖玻片，去掉盖玻片上多余的多聚赖氨酸，自然晾干，经过处理的一面粘住载玻片，这样就形成了一合肥工业大学学报（自然科学版）第 卷个通道。在连续静置培养大肠杆菌的生长过程中，每日早上离心后倒入新鲜的 培养基，在以后到达稳定期，然后取出菌液，测菌液的 值为 。将稀释好的菌液用移液枪吸取 ，加入 离心管中，离 心 、，去掉上清。然后取 溶液清洗一遍菌体，离心 、，去掉上清。用移液枪吸取 的 溶液加入离心管中与剩余菌体混合均匀，使细菌均匀悬浮于 的 溶液中。使用移液枪吸取 的细菌悬浮液慢慢地打入切片的通道中，接下来将做好的切片倒置处理 ，即让盖玻片在下面，载玻片在上面。让细菌与多聚赖氨酸（）溶液充分接触，便于细菌沾到盖玻片上，以便观察大肠杆菌的形态。后再将切片正置放好，吸取 的 溶液，将其缓慢通过切片通道进行清洗，目的是将没有粘到盖玻片上的细菌清洗掉。最后用 公司生产的 型油脂（）将切片通道两端封住，完成了切片的制备。接下来立即将制备好的切片拿到显微镜下进行实验观察。结果与分析.的生长动力学分析研究表明.菌株能在连续静置的 培养 基 中 生 长 速 度 加 快，为 此 测 试.在 培养基中的生长状况。本文使用一种名为 （）的野生型菌株，该菌株是.菌株 的衍生物。本文将带有黏性细丝 的质粒 转入到 中。.连续的生长曲线如图所示。图.连续的生长曲线由图可知，.的生长速度加快，到达稳定期的时间缩短。第天连续培养.，以后到达稳定期；第天连续培养.，到达稳定期；第 天连续培养.，以内到达稳定期。结果表明：.在连续的静置 培养中，生长速度加快，到达稳定期的时间缩短。.的运动性分析在静 置 培 养 中，.的生长动态连续发生变化，因为要了解这是否会影响.的运动性，所以本文选择连续.生长的稳定期进行研究。本文首先对种大肠杆菌（野生 型 大 肠 杆 菌 和 大 肠 杆 菌 ）的鞭毛马达的转速进行分析，.的鉴定结果如图所示。因为野生型.（）无鞭毛基因，所以无鞭毛运动，作为对照组；.是导入了表达鞭毛基因的质粒 ，因此使细菌获得了运动能力和可以标记乳胶小球的能力。图.的鉴定结果本文鞭毛马达的动力学分析需要利用乳胶小球粘附在.的鞭毛上，通过倒置显微镜 观察.运动速度的变化。利用.鞭毛马达的顺时针速度和逆时针速度作运动指标，并用 分析鞭毛马达的转速。连续培养.鞭毛马达的顺时针转速如 图 所 示。图 中：表 示 ；表示 ，下同。从图可以看出，连续静置培养.的顺时针转速分别为（）、（）、（）、（）、（），连续研究的有效细菌数为、。.的顺第期王媛，等：连续静置培养促进大肠杆菌生长和运动时针转速逐渐提高。连续培养.鞭毛马达的逆 时 针 转 速 如 图 所 示，其 中，表 示。从图可以看出，连续 的.的逆时针转速分别为（）、（）、（）、（）、（），每天研究的有效细菌个数分别为、。与第天相比，第天的逆时针转速提高了；第、天与第天相比没有显著性差异，但是转速有所提高。在第天时，细菌鞭毛运动的逆时针转速达到约 ，与第天相比增 加 了 约 。结 果 表 明：.在连续的静置 培养中，运动性增强，.的逆时针转速连续上升，而顺时针转速表明运动环境的不利因素也在增加，这与.数量的增加是一致的，次生毒性代谢产物也在增加。图.鞭毛马达的顺时针转速图.鞭毛马达的逆时针转速 和 的运动影响分析为 了 验 证 和 在.运动中的重要性，本文将.（）、.（）和.进行连续的静置 培养，然后在泳动培养基上观察细菌游动的直径。种.菌株连续的群体运动如图所示。图中：.为缺少鞭毛 基因的菌株；.（）为缺少运动蛋白基因的菌株；.为有运动基因并且有鞭毛的菌株；将培养第天的菌液稳定期的细菌取出滴在泳动固体培养基上，孵育 拍照；第天以此类推。从图可以看出，.游动的直径在连续培养的静置培养中发生变化，随着培养天数的增加，.游动的直径增大。与 对 照 组相 比，当 同 时