龙珠软膏对银屑病模型小鼠治疗作用的研究_张喻.pdf

基金项目湖北省科技重大专项（编号：）；湖北省科技重大专项（编号：）作者简介张喻，女，硕士研究生在读，研究方向：中药成分及药理作用 通信作者熊慧，女，博士，副教授，硕士研究生导师，研究方向：中药药效物质基础与作用机制龙珠软膏对银屑病模型小鼠治疗作用的研究张喻，向雪川，周正繁，梅之南，熊慧（中南民族大学药学院，湖北 武汉 ；华中农业大学植物科学技术学院，湖北 武汉 ）摘要目的：探讨龙珠软膏对咪喹莫特（，）诱导的银屑病小鼠的治疗作用及可能的作用机制。方法：只雄性 小鼠，随机分为正常组、模型组、阳性药组（）及龙珠软膏高、中、低（，）剂量组，每组只。除正常组外，其余组小鼠向小鼠剃毛处均匀涂抹（），正常组均匀涂抹凡士林（），连续涂抹 ，从第天开始给药，连续 。从第天开始记录小鼠自发挠痒行为 ，连续录像 ，统计小鼠挠痒次数。根据银屑病皮损面积及严重程度指数（，）评分、小鼠行为学和皮肤形态学评价龙珠软膏的治疗效果。利用流式细胞术检测小鼠脾脏中的 细胞比例，检测小鼠颈部皮肤组织中 、等主要细胞因子 的表达量，法检测小鼠颈部皮肤中 、的蛋白表达。结果：龙珠软膏能降低 评分、抑制小鼠挠痒次数，缓解皮肤表层角质化和炎症细胞浸润。此外，可降低由 引起的小鼠皮肤中 细胞比例，下调小鼠皮损区、的表达，抑制小鼠皮损区 、的蛋白表达。结论：龙珠软膏在改善银屑病小鼠的症状上疗效确切，与给药剂量呈剂量依赖性，其作用可能与抑制 和 信号通路有关。关键词银屑病；龙珠软膏；炎性因子；抗炎；止痒 中图分类号 文献标识码 文章编号 （）：，（，；，）：（），（），（，）（），（）（，），：；银屑病是一种慢性免疫介导的炎症性皮肤病，可与多种以慢性炎症为特征的疾病相伴发作。该病的主要特征是异常的 细胞活化和角质形成细胞的过度增殖。除了皮肤表现，银屑病还与多种代谢合并症有关，如肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病。银屑病的全球患病率为 ，近年来患病人中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，数有上升的趋势。中医认为银屑病的病因病机主要为营血亏损、化燥生风，复感风热毒邪、肌肤失养。血热是内在因素，外感六淫之邪，郁久化火，热毒蕴伏营血，发展为血燥。龙珠软膏在现代医学中主要用于清热解毒、消肿止痛等，现广泛用于肛瘘术后恢复、压疮、湿疹等疾病的治疗，其主要成分有人工麝香、人工牛黄、炉甘石等，其中炉甘石外用收湿、止痒、敛疮；牛黄、硼砂等对清热解毒、减缓患处水肿、减少创面分泌物等有明显优势。然而目前尚无龙珠软膏治疗银屑病的相关报道。鉴于此，本研究拟通过建立 诱导的小鼠银屑病模型，观察龙珠软膏对银屑病小鼠抗炎、止痒的作用及探究其分子机制，以期为相关临床治疗提供一定的理论依据。材料 仪器 型医用离心机（北京博励行仪器有限公司）；型微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；型实时荧光定量 仪（美国 公司）；型电泳仪（北京市六一仪器厂）；型快速转膜仪（美国 公司）；型 成像分析系统（上海天能科技有限公司）。药品与试剂龙珠软膏（马应龙药业集团股份有限公司，批号 ）；咪喹莫特乳膏（四川明欣药业股份有限责任公司，批号 ）；丁酸氢化可 的 松 乳 膏（天 津 金 耀 药 业 有 限 公 司，批 号 ）；蛋白 抗体、蛋白 抗体、蛋白 抗体（，批号分别为 ，）；凝胶快速 配 置 试 剂 盒（碧 云 天 生 物 技 术，批 号 ）。动物 只周龄 雄性小鼠，体质量（），购自辽宁长生生物技术股份有限公司 实验动物合格证号：（辽）。将实验动物分笼饲养在中南民族大学 级环境中 温度（），明暗周期循环。所有小鼠在实验前先适应环境一周。本实验方案及规程符合动物实验伦理规范，经过中南民族大学动物实验伦理委员会的审核并批准（伦理批件号：）。方法 诱导小鼠银屑病模型的建立将所有小鼠随机分为空白组、模型组、丁酸氢化可的松组（）及龙珠软膏低、中、高剂量组（，），每组只。小鼠适应环境期间将其颈部 区域毛发剃光。模型组与给药组将 均匀涂抹于造模处皮肤，使小鼠每天致敏次，连续 ，空白组每天相同时间与方法给予相同剂量的凡士林。实验开始 后，将龙珠软膏低、中、高剂量组采取皮肤涂抹给药方式连续 每天次应用于小鼠颈部皮肤。阳性药组每只给予丁酸氢化可的松乳膏，给药时间和频率与给药组相同。在第，天，记录并观察小鼠抓挠的行为学变化。检测指标和方法 小鼠皮损评分小鼠出现皮肤损伤的严重程度采用 进行评估，该指数基于红斑、浸润及鳞屑个方面的严重程度各分为个等级，分别计分，总分 分。观察小鼠抓挠的行为学通过小鼠的抓挠次数判断各组的瘙痒严重程度。小鼠前 下午涂抹龙珠软膏，第天早上记录小鼠 内的挠痒情况，通过回放视频统计小鼠抓挠次数。当老鼠举起后爪连续抓挠被抓区域次或几次，然后将后爪落在地上或收回时代表次抓挠结束。组织病理学伊红（）及甲苯胺蓝染色检测取材当天，麻醉小鼠，将小鼠颈部造模处皮肤组织剪下，放入多聚甲醛中，包埋，切片。用苏木精和、甲苯胺蓝染色后封片。显微镜观察并拍摄病理变化图像。脾脏中 细胞的检测取材当天，处死所有小鼠，收集小鼠脾脏置于培养皿，研磨过滤后 冲洗，得到脾脏组织悬液，加入红细胞裂解液，混匀后离心弃上清，将细胞重悬，从重悬过滤后的 细胞悬液中取 ，离心后弃上清，按要求加入 混匀，室温避光孵育 ，离心弃上清，加入破膜试剂，室温孵育 ，再加入 混匀，加入破核试剂（）配制，室温孵育 ，再离心弃上清，加 重悬，上机检测。法检测目的基因取材当天，麻醉小鼠后，取小鼠颈部造模部位皮肤，加入 ，组织研磨仪磨碎，按照步骤提取总 ，根据 逆转录试剂盒说明书体外合成为 ，以 为内参基因，计算目的基因的相对表达量。引物序列见表。小鼠皮肤组织中 、蛋白表达检测对小鼠剩余皮肤组织进行组织蛋白提取。在皮肤中加入蛋白裂解缓冲液，使蛋白充分裂解后离心，取上清液进行下一步。样品在 上样缓冲液中变性，金属浴加热 即得。蛋白质的表达，配制分离胶、浓缩胶，蛋白中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，表引物序列 引物正向序列（）反向序列（）上样，电 泳，转 膜，封 闭，孵 一 抗、孵 二 抗，显 影，软件分析获得条带灰度值，分析小鼠皮肤 组 织 、蛋 白表达。统计学处理通过 软件处理数据，计量资料均以表示，多组间样本均数采用单因素方差比较，表示差异具有统计学意义。结果 龙珠软膏对银屑病模型小鼠皮损严重程度的影响模型组小鼠造模处皮肤出现较多皮屑且有红色斑痕，皮肤损伤严重；与模型组相比，龙珠软膏给药组和丁酸氢化可的松组小鼠皮肤损伤均有缓解。相较于空白组，模型组小鼠 评分明显升高（）；龙珠软膏中、高剂量和丁酸氢化可的松治疗后，小鼠 评分明显降低（），见图。龙珠软膏对银屑病模型小鼠挠痒行为学的影响与空白组相比，模型组小鼠抓挠次数增加（），提示 引起强烈的抓挠行为；与模型组相比，第，天丁酸氢化可的松组及龙珠软膏高剂量组小鼠挠痒次数均减少（），且龙珠软膏的作用呈剂量依赖性。见图。龙珠软膏对银屑病模型小鼠皮肤组织病理变化的影响如图，与空白组比较，模型组小鼠颈部皮肤出现严重的角化及炎症细胞浸润，表皮层厚度增加（）；与模型组比较，龙珠软膏各剂量组炎症细 胞 浸 润 情 况 减 轻，表 皮 层 厚 度 变 薄（）。图显示，与空白组比较，模型组小鼠皮肤 空白组（）；模型组（）；龙珠软膏低剂量组（）；龙珠软膏中剂量组（）；龙珠软膏高剂量组（）；丁酸氢化可的松组（）图各组小鼠皮损形态（）及 评分（）（，）（）（）（，）注（）：与空白组比较（），；与模型组比较（），。空白组（）；模型组（）；龙珠软膏低剂量组（）；龙珠软膏中剂量组（）；龙珠软膏高剂量组（）；丁酸氢化可的松组（）图第天（）、第天（）、第天（）各组小鼠挠痒次数（，）（），（）（）（，）注（）：与空白组比较（），；与模型组比较（），。中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，空白组（）；模型组（）；龙珠软膏低剂量组（）；龙珠软膏中剂量组（）；龙珠软膏高剂量组（）；丁酸氢化可的松组（）图各组小鼠颈部皮肤表皮厚度（）及染色统计图（）（，）（，）注（）：与空白组比较（），；与模型组比较（），。空白组（）；模型组（）；龙珠软膏低剂量组（）；龙珠软膏中剂量组（）；龙珠软膏高剂量组（）；丁酸氢化可的松组（）图各组小鼠颈部皮肤肥大细胞数量（）及甲苯胺蓝染色统计图（）（，）（）（）（，）注（）：与空白组比较（），；与模型组比较（），。水肿情况严重，肥大细胞数激增（）；与模型组比较，龙珠软膏各剂量组小鼠水肿情况有不同程度减轻，肥大细胞浸润情况改善，中剂量组与高剂量组肥大细胞数减少明显（）。龙珠软膏对银屑病模型小鼠脾脏中 细胞的影响流式细胞术检测结果显示，相较于空白组，模型组小鼠脾脏中 细胞比例升高（）；相较于模型组，龙珠软膏给药组（）小鼠脾脏中 细胞比例下降（图）。龙珠软膏对银屑病模型小鼠颈部皮肤组织、表达的影响与空白组比较，模型组小鼠颈部皮肤组织中、表达升高（）；与模型组比较，丁酸氢化可的松软膏组及龙珠软膏各给药组小鼠颈部皮肤组织中、表达降低（，），见图。龙珠软膏对银屑病模型小鼠颈部皮肤组织中蛋白表达的影响如图所示，相较于空白组，模型组小鼠颈部皮肤组织中 、的磷酸化水平及 表达升高（）；相较于模型组，丁酸氢化可的松组及龙珠软膏各剂量组小鼠颈部皮肤组织中 、的磷酸化水平与 表达降低（，），提示龙珠软膏可能通过阻断 与 信号通路发挥其治疗作用。讨论银屑病是不受控制的角质形成细胞增殖的结果，其发病机制涉及免疫系统失调。树突状细胞，、和 细胞释放的细胞因子之间的相中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，空白组（）；模型组（）；龙珠软膏中剂量组（）图各组小鼠脾脏中 细胞的比例（，）（，）注（）：与空白组比较（），。空白组（）；模型组（）；龙珠软膏低剂量组（）；龙珠软膏中剂量组（）；龙珠软膏高剂量组（）；丁酸氢化可的松组（）图各组小鼠皮肤炎性因子（）、（）、（）、（）、（）表达水平（，）（），（），（），（）（）（，）注（）：与空白组比较（），；与模型组比较（），。空白组（）；模型组（）；龙珠软膏低剂量组（）；龙珠软膏中剂量组（）；龙珠软膏高剂量组（）；丁酸氢化可的松组（）图各组小鼠颈部皮肤中蛋白条带（）及 （）、（）、（）、（）蛋白表达水平（，）（）（），（），（），（）（，）注（）：与空白组比较（），；与模型组比较（），。互作用导致银屑病的表型表现。对银屑病发病机制的研究最早关注的是肥大细胞。肥大细胞是过敏性和快速炎症介导节点，它可调节机体免疫功能，也可诱发和扩大炎症，通过作用于内在免疫和适应性免疫刺激 细胞反应参与银屑病的治疗过程。银屑病作为一种研究中比较常见的皮肤病，其主要特征之一是持续性瘙痒引发抓挠，从而导致皮肤出现更严重的损伤。目前对银屑病还没有确切的治愈方法，当前使用一些药物治疗过程中症状不易控制且时常恶化更甚者引发感染，对疾病的治疗十分不利。基于龙珠软膏在消炎止痛方面效果显著，研究龙珠软膏对 诱导的银屑病小鼠的抗炎作用及其可能的止痒机制十分必要。本研究经过局部使用 建立了银屑病小鼠模型。模型小鼠表现出与人银屑病相似的临床和免疫学症状。受刺激的小鼠颈背部皮肤发红、隆起中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，且覆盖有较厚的鳞屑伴随瘙痒，反映了各种炎性细胞中炎性因子的分泌与表达。据报道，银屑病发病过程中，可能存在多种病因和发病机制，主要原因为 细胞的大量富集，特别是 细胞，且这类细胞大量分泌的多种促炎细胞因子对银屑病的病程有很大影响。通过分泌不同的细胞因子可以将辅助细胞区分为不同的亚族，细胞的特征是分泌 ，而、会促进 细胞的分化。本研究结果显示，在银屑病小鼠皮肤中检测到高水平的，且 、水平均升高；龙珠软膏可以降低皮肤中这些细胞炎性因子的上调水平，与文献 结果相似，提示龙珠软膏对皮肤中相关细胞炎性因子水平有抑制作用，证明其有止痒作用。白细胞介素（，）是主要由巨噬细胞产生的一种促炎性细胞因子，是体内调节免疫和炎症反应的核心媒介，影响许多慢性炎症和其他一些自身免疫疾病的发展过程。有研究表明，作为炎症细胞因子，不但可引发银屑病的炎症浸润，亦可影响角质形成和分化而影响银屑病皮损的形成，系统已被证实与银