联合接种原生动物和木霉对黄...生长及土壤微生物区系的影响_莫雅旎.pdf

南京农业大学学报，（）：收稿日期：基金项目：江苏省自然科学基金青年基金项目（）；中央高校基本科研业务费专项资金（）；江苏省政策引导类计划（国际科技合作 港澳台科技合作）项目（）；大学生创新训练计划项目（）作者简介：莫雅旎，硕士研究生。通信作者：李荣，教授，博士，从事土壤微生物分子生态学研究，：。莫雅旎，郭赛，欧燕楠，等 联合接种原生动物和木霉对黄瓜生长及土壤微生物区系的影响 南京农业大学学报，（）：，（）：联合接种原生动物和木霉对黄瓜生长及土壤微生物区系的影响莫雅旎，郭赛，欧燕楠，焦子轩，黄若菱，李荣，沈宗专，沈其荣（南京农业大学资源与环境科学学院 江苏省固体有机废弃物资源化研究重点实验室 江苏省有机固体废弃物协同创新中心 教育部资源节约型肥料工程技术研究中心，江苏 南京；瓦赫宁根大学，荷兰 瓦赫宁根）摘要：目目的的 本文旨在探究吞噬性原生动物、真菌及两者联合对黄瓜生长和土壤微生物群落组成的影响。方方法法 供试黄瓜品种为露丰黄瓜，采用盆栽试验，设计不接种对照（）、单独接种贵州木霉（）（处理）、单独接种丝竹虫（）（处理）、组合接种丝竹虫和贵州木霉（处理）个处理，处理 周后采集植株及土壤样品，评估各处理对黄瓜性状及土壤细菌和真菌群落的影响。结结果果 相较于，、和 个处理黄瓜株高分别增加、和，生物量分别提高、和，即贵州木霉和丝竹虫均能促进黄瓜生长且两者组合能够进一步增强促生效应。基于主坐标分析发现，个处理均显著改变了土壤细菌和真菌群落组成，随机森林模型进一步发现细菌和真菌群落组成是影响黄瓜生物量的主要因素。线性判别分析发现，与 相比，个处理分别激发、和 个关键细菌操作分类单元（），、和 个关键真菌；处理激发了更多的与黄瓜促生相关的，其中，有 个关键细菌 仅在 处理中被激发，对黄瓜促生贡献最大的分别归属于、和；有 个关键真菌 仅在 处理中被激发，对黄瓜促生贡献最大的分别归属于隔指孢属、和毛壳菌属。结结论论 相比于单一接种，丝竹虫和木霉组合接种后能更显著促进黄瓜生长，两者协同调控土著细菌和真菌群落，激发并富集潜在的土著功能微生物以塑造更有利于黄瓜生长的土壤微生物群落。关键词：黄瓜；原生动物；木霉；接种；土壤微生物群落；促生中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，；，）：，（）：（），.（），（），.（），.，.南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 ，.；.，.，.，.：；土壤微生物具有为植物生长提供所需营养元素、平衡植物激素和抑制病原菌等功能，在农业绿色可持续生产中发挥着重要作用。因此，调控与植物性能密切相关的土壤微生物群落，是发展高产高效农业的有效措施之一。目前对土壤微生物区系的调控大多是通过引入一种或多种有益细菌或真菌，它们既能直接发挥促生或防控土传病害功效，还可通过影响土著微生物群落的组成和功能间接对植物产生有益作用。有益菌接种到土壤后其功能的发挥与土著微生物间的相互作用紧密相关。木霉是土壤中广泛分布的重要促生真菌，能够通过产活性物质直接促进植物生长和激发潜在土著有益菌间接促进植物生长。有研究发现，利用贵州木霉（）研制的生物有机肥可调节土壤微生物区系，从而提高作物产量。土壤原生动物泛指生活在土壤或土壤表面凋落物中可捕食其他微生物的原生生物，是土壤微生物食物网的重要组成部分，也是塑造土壤微生物群落的关键因子。土壤原生动物对细菌、真菌的选择性捕食可自上而下地调控菌群组成，改变土壤微生物群落功能。已有研究发现，原生动物可作为潜在的植物促生接种剂，其与细菌联合接种后可显著增加植株生物量，提高土传病原菌抑制能力，促进植物健康生长。本实验室前期研究发现，土壤中单独接种吞噬性原生动物丝足虫（）能促进黄瓜植株生长，其联合贵州木霉 接种后能够进一步促进植物生长；单独接种丝竹虫于伽马射线灭菌的无菌土壤并不具有促生效果，其联合贵州木霉 接种后，也未体现出与单独接种贵州木霉 更优的促生效果，表明吞噬性原生动物丝足虫通过操纵土壤细菌和真菌群落，从而起间接促生作用。然而，外源原生动物单独及其联合有益真菌接种后，如何通过调控土壤微生物群落促进植物生长的研究较少。本研究采用盆栽试验，通过向土壤中接种有益真菌贵州木霉（）和吞噬性原生动物（），研究原生动物和有益微生物在单独接种及组合接种后对植物生长的影响；并通过高通量测序技术进一步研究单独及组合接种对土壤中土著细菌和真菌群落的影响，探究吞噬性原生动物有益真菌土著微生物植物生长间的相互作用机制，以期为农业绿色可持续生产提供理论依据。材料与方法 供试材料 供试作物 供试黄瓜品种为露丰黄瓜，种子购于江苏省江蔬种苗科技有限公司。供试菌株 供试原生动物和木霉分别为本实验室保存的丝足虫（）和贵州木霉 （）。供试土壤 供试土壤采自江苏省南京市蔬菜科学研究所（，）设施蔬菜大棚，该区域年平均气温 ，平均降雨量为 。该大棚于 年 月起连续种植黄瓜，本试验所用土壤于 年 月采集于其中的化肥处理，该处理连续施用纯化肥。采集当季基肥施用量为：氮肥 ，磷肥（），钾肥（）；追肥施用量为：氮肥 ，钾肥（）第 期莫雅旎，等：联合接种原生动物和木霉对黄瓜生长及土壤微生物区系的影响 。试验设计盆栽试验共设计 个处理：）处理：土壤中添加 含有 孢子的 缓冲液（缓冲液：蒸馏水中溶解 ，）；）处理：土壤中添加 含有.细胞的 缓冲液；）处理：土壤中添加 含有.细胞和.孢子的 缓冲液；）对照（）处理：土壤中添加 缓冲液。每个处理 个重复。盆栽采用聚丙烯花盆，.和.接种浓度均为（干土）。加样时先将配制溶液均匀接种到土壤中，再加入达到土壤含水量 的无菌水。盆栽试验于南京农业大学温室进行，培育过程中用无菌水补水，定期随机摆放花盆。样品采集与测定方法 样品采集 处理 周后采集植株及根际土壤样品。植株样品采集：采集黄瓜植株的地上部部分。根际土壤样品采集：收集黄瓜植株全部根系，带回实验室后将根系放入含有无菌水的离心管中，置于控温摇床振荡，获得根际土壤悬液，将根际土壤悬液 离心 ，弃上清液后获得根际土壤样品。植物性状测定 植物地上部采回后测量植株株高，随后装入信封于 烘箱干燥 后称量地上部干重。土壤 提取 参照 （，德国）的操作说明提取土壤。利用核酸定量仪（，）测定 和 的比值以确定所提取 的质量。高通量测序与序列处理细菌 基因 区域的扩增引物为（）和（）；真菌 区域的扩增引物为（）和（）。反应体系（）：灭菌超纯水 ，反应缓冲液（），增强添加剂（）（），（），模板 ，引物（），引物（），聚合酶（）。扩增、文库准备及上机测序程序均委托广州美格生物科技有限公司完成。对原始序列进行质控、拼接并过滤嵌合体后，基于 相似度水平聚类生成 表格（，），并得到 的代表序列。将代表序列上传（）数据库进行对比分类，细菌（基因）选用 数据库，真菌（序列）选用 数据库。数据处理与分析将细菌和真菌 表格转化成 格式文件后，利用 软件计算群落丰富度指数（）和多样性指数（），以表征处理间 多样性差异。基于 距离对各样品进行主坐标分析（，），以比较各处理间群落结构的差异，进一步通过 的“”命令进行相似性分析（）以评估处理间微生物群落结构间的差异显著性。使用 软件包（）计算 相关系数以评估各细菌和真菌 与植物生物量的相关性；对各处理包含的与生物量正相关的关键微生物（筛选标准为相关系数，且平均相对丰度）进行线性判别（）分析，再使用 软件包中的“”对关键微生物 在各处理中的相对丰度进行聚类分析。采用 、软件进行数据处理和统计分析，单因素 分析中显著性检验采用 法计算（）。结果与分析 不同处理对黄瓜生物学性状的影响由图 可知：与 相比，、及 处理均能增加黄瓜的株高和地上部生物量，且 和 处理促生效果显著（），、处理植株株高分别增加、和，生物量分别增加、和。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 各处理黄瓜株高（）和生物量（）.（）（）：对照处理；：接种木霉处理；：接种丝足虫处理；：组合接种丝足虫与木霉处理。不同字母表示处理间差异显著（）。下同。：；：.；：；：.不同处理对黄瓜根际细菌及真菌群落 多样性的影响由图 可知：与 相比，处理显著提高了黄瓜根际细菌群落的丰富度（），和 处理显著降低了根际细菌群落多样性（）。与 相比，个处理未显著影响根际真菌群落的丰富度和多样性（）。图 不同处理对黄瓜根际细菌丰富度（）、多样性（）和真菌丰富度（）、多样性（）的影响.（），（），（）（）不同处理对黄瓜根际细菌及真菌群落结构的影响由图 可知：基于 距离的主坐标分析以及 分析表明，相较于，、以及 处理均显著改变根际细菌和真菌的群落结构（）。细菌和真菌多样性以及群落结构对黄瓜生物量的相对重要性分析随机森林模型结果（图）表明，根际细菌与真菌群落结构是黄瓜生物量的主要影响因子（），其中细菌群落对黄瓜生物量的相对重要性大于真菌群落（细菌，真菌），而根际细菌和真菌的多样性对黄瓜生物量的影响不显著（）。不同处理对黄瓜根际细菌及真菌群落组成的影响对根际中细菌和真菌门水平微生物组成分析，结果（图）表明：细菌群落中的变形菌门、拟杆菌门、酸杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、芽单胞菌门、疣微菌门、绿弯菌门、浮霉菌门、第 期莫雅旎，等：联合接种原生动物和木霉对黄瓜生长及土壤微生物区系的影响图 基于 距离的黄瓜根际细菌（）和真菌（）群落结构主坐标分析.（）（）（）图 细菌和真菌群落多样性和结构对黄瓜生物量的相对重要性.，硝化螺旋菌门、装甲菌门的相对丰度较高，占细菌序列总丰度的。与 相比，处理显著提高硝化螺旋菌门、酸杆菌门、装甲菌门、厚壁菌门和变形菌门的相对丰度；处理显著提高放线菌门、疣微菌门、变形菌门和 的相对丰度；处理显著提高放线菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门、疣微菌门、酸杆菌门、装甲菌门、厚壁菌门、变形菌门及 的相对丰度（）。真菌群落中的子囊菌门、担子菌门、接合菌门、壶菌门的相对丰度较高，占真菌序列总丰度的（图）。与 相比，和 处理显著提高接合菌门的相对丰度，处理显著提高子囊菌门的相对丰度（）。图 各处理中黄瓜根际细菌门水平（）和真菌门水平（）相对丰度.（）（）不同处理对潜在关键微生物的影响及其与黄瓜生物量的关系对相对丰度大于 的细菌和真菌 与生物量进行斯皮尔曼相关性分析发现，共有 个细菌 和 个真菌 与黄瓜植株生物量呈显著正相关关系（），即为促进黄瓜生长的潜在关键微生物。由图 可知：与 相比，处理激发了 个关键细菌，处理激发了 个关键细菌，处理激发了 个关键细菌；其中，有 个关键细菌 在 处理和 处理中被同时激发，归南 京 农 业 大 学 学 报第 卷属于红细菌属、草螺菌属、伦黑墨氏菌属、硝化螺菌属、纤线杆菌属、嗜氨菌属、地嗜皮菌属、噬细胞菌属、及；有 个关键细菌 在 处理和 处理中被同时激发，归属于芽胞杆菌属、假单胞菌属、丰佑菌属、土地杆菌属、鞘脂菌属、中慢生根瘤菌属、黄色土源菌属、红球菌属、贪噬菌属、德沃斯氏菌属、金黄杆菌属、鞘脂单胞菌属、柄杆菌属和微杆菌属；有 个关键细菌 在、和 处理中被共同激发，归属于固氮螺旋菌属、剑菌属、鞘脂菌属、农杆菌属、嗜糖假单胞菌属、及。由图 可知：与 相比，处理激发了 个关键真菌，处理激发了 个关键真菌，处理激发了 个关键真菌；其中，有 个关键真菌 在 处理和 处理中被同时激发，归属于丝盖伞属；有 个关键真菌 在 处理和 处理中被同时激发，归属于肉座菌属、毛霉菌属和大环柄菇属；有 个关键真菌 在、和 处理中被共同激发，归属于。图 不同处理中黄瓜根际富集的潜在促生细菌（）和真菌（）数量.（）（）图 不同处理潜在促生细菌（）和真菌（）的相对丰度.（）（）进一步对每个处理相较于其他处理单独激发的关键微生物分析发现（图），无关键细菌 仅在 处理中被激发；有 个关键细菌 仅在 处理中被激发，归属于拟无枝酸菌属、柄杆菌属、寡养单胞菌属、及鞘氨醇杆菌属；有 个关键细菌 仅在 处理中被激发，归属于、斯科曼 氏 球 菌 属、黄 杆 菌 属、滑 柱 菌 属、伴根瘤菌属、柯恩氏菌属、微小杆菌属、生丝微菌属、小单孢菌属及。从图 可见，无关键真菌 仅在 处理被激发；有 个关键真菌 仅在 处理中被激发，归属于柄孢壳菌属和；有 个