理性改造光脱羧酶并用于反式脂肪酸选择性脱羧反应_曾森海.pdf

Univ.Chem.2023,38(4),243252 243 收稿：2022-10-04；录用：2022-12-11；网络发表：2023-01-16*通讯作者，Email: 基金资助：国家自然科学基金面上项目(22277053)；江苏省自然科学基金青年科学基金项目(BK20220760)化学实验 doi:10.3866/PKU.DXHX202210002 理性改造光脱羧酶并用于反式脂肪酸选择性脱羧反应理性改造光脱羧酶并用于反式脂肪酸选择性脱羧反应 曾森海，鲍雨妍，曹奡，黄小强*配位化学国家重点实验室，南京大学化学与生物医药创新研究院，南京大学化学化工学院，南京 210023 摘要：摘要：立足光酶催化合成和酶的理性改造等研究前沿，设计了一例光酶催化的反式脂肪酸高选择性脱羧去除实验。具体地，本实验借助分子对接技术，理性设计脂肪酸光脱羧酶CvFAP的突变体V453E-CvFAP，并实验验证该突变体能够选择性地催化反油酸的脱羧反应，从而实现顺式脂肪酸的富集。实验涉及培养细胞、诱导酶表达、提取酶液、设计反应以及产物的定性、定量分析等内容，非常适合在化学生物学实验或综合化学实验课程中开设。关键词：关键词：酶的理性改造；脂肪酸光脱羧酶CvFAP；反式脂肪酸；光酶催化；脱羧反应 中图分类号：中图分类号：G64；O6 Rational Evolution of a Fatty Acid Photodecarboxylase for Highly Selective Photodecarboxylation of trans Fatty Acid Senhai Zeng,Yuyan Bao,Ao Cao,Xiaoqiang Huang*State Key Laboratory of Coordination Chemistry,Chemistry and Biomedicine Innovation Center,School of Chemistry and Chemical Engineering,Nanjing University,Nanjing 210023,China.Abstract:Photoenzymatic synthesis and rational engineering of enzymes are among the most emerging research areas.Herein,a highly selective photodecarboxylation of trans fatty acid was achieved by rational repurposing of the photodecarboxylase.Specifically,via molecular docking,a mutant of the photodecarboxylase CvFAP,namely V453E-CvFAP,was rationaly designed,constructed and subjected to the photoactivated decarboxylation of fatty acids.It turned out that the mutant was highly selective towards elaidic acid,thereby enriching oleic acid.Experimental trainings like cells culturing,protein expression,reaction design,and qualitative and quantitative analysis of products were included.The experiment is easy to conduct and safe for undergraduate chemistry experiment.Key Words:Rational evolution of enzyme;Photodecarboxylase CvFAP;Trans fatty acid;Photobiocatalysis;Decarboxylation 1 引言引言 1.1 光酶催化反应和酶的理性设计引入化学类本科实验教学的意义光酶催化反应和酶的理性设计引入化学类本科实验教学的意义 酶催化具有高效高选择性和绿色可持续等优点，不仅是化学生物学等学科的前沿研究热点，也有望部分替代传统石油化学经济、满足国家绿色发展需求。然而在相对滞后的本科生化学实验课程中，酶催化反应还缺乏应有的关注。特别地，光酶催化综合了可见光催化多样的反应性和酶催化的优势，成为了扩展酶催化功能的重要策略1。光酶催化在诸多应用领域都有非常好的发展前景，如光脱羧酶可以催化生物质来源的脂肪酸转化为有机燃料2、高选择性地催化反式脂肪酸脱244大 学 化 学Vol.38羧3等。另一方面，定向进化通过连续迭代的基因多样化和蛋白库的筛选过程，在实验室试管中加速模拟了自然界的进化过程，已成为最强大的生物学工具之一，被广泛地应用于合成生物学元件、代谢通路和整个基因组的设计改造4。2018年诺贝尔化学奖的1/2授予加州理工的Frances H.Arnold，以表彰其在定向进化领域的突出贡献。然而，传统的定向进化手段依赖于随机突变和高通量筛选，需要耗费大量人力、物力、财力。理性设计对酶的结构进行精确地调控，来获得具有所需催化活性的新酶，成为了人们的新选择5。将光酶催化和酶的理性改造这样的新理论、新方法、新技术引入化学类本科实验教学，不仅可以让教学内容更贴近实际、贴近前沿，提高实验教学的新颖性、创新性和趣味性，让学生接触前沿的理论和技术，培养学生的实验技能，同时可以让本科生更直观地感受光酶催化和酶的理性改造的优越性和先进性，培养学生从事相关研究的兴趣。1.2 实验项目及背景情况实验项目及背景情况 随着科技进步和和社会发展，全人类更加关注生命健康相关问题。习近平总书记也曾作出“科技事业发展要面向人民生命健康”这一重要指示。因此，面向生命健康的化学研究尤为重要。食用油是日常生活中必不可少的一项烹饪用品，目前大众食用的植物油主要由饱和脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸等)和不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸等)组成。研究表明，过量摄入饱和脂肪酸会增加心血管疾病的风险6，与饱和脂肪酸相比，不饱和脂肪酸更健康，它可以预防心律失常，并可能降低血压7。然而，并非所有不饱和脂肪酸都是健康的，研究表明，反式脂肪酸对人类有一些显著的副作用，如诱发心脏病、导致代谢功能障碍等7。2006年，美国食品药品监督管理(FDA)规定，所有食品和保健品的标签必须标明反式脂肪酸的含量8。中国居民膳食指南也建议每日摄入反式脂肪酸不超过2 g 9。因此，将反式脂肪酸从不饱和脂肪酸混合物中去除是一个非常重要的食品安全研究课题。生物催化具有反应选择性高、条件温和、绿色环保等优点5，被认为是解决此问题的有效方法。2017年，Bession及其同事10报道了一种来自小球藻NC64A的脂肪酸光脱羧酶(CvFAP)，其在特定光照下，可将长链脂肪酸转化为相应烃类。2021年，Bession及其同事11揭示CvFAP的催化功能依赖于位于酶活性中心的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅基的激发态化学转化。Hollmann及其同事12,13利用CvFAP和其他酶开发了一系列级联反应以获得有价值的有机物。2021年，浙江大学吴起/徐鉴团队3报道了光酶催化选择性消除反式脂肪酸的新颖转化，他们发现，野生型CvFAP对反式脂肪酸选择性不高，几乎无法实现从混合物中选择性去除反式脂肪酸。该团队通过理性改造获得了CvFAP的突变体，成功实现了选择性的脱羧消除反式脂肪酸，扩大了CvFAP的应用范围。为了将光酶催化和酶的理性改造技术引入本科实验教学，本实验以该团队报告的CvFAP选择性消除反式脂肪酸为基础，对光脱羧酶催化的反应条件做了进一步的探究，使其更加适合本科实验教学。本实验采用大肠杆菌作为模型细胞，将含有CvFAP基因的菌种进行扩大培养和诱导表达，获取粗酶溶液。本实验为1 mL(100 L甲醇溶液+900 L粗酶溶液)反应体系，反应底物为油酸(oleic acid)和反油酸(elaidic acid)，底物溶剂为甲醇与缓冲液，底物浓度3.50 mmolL1，酶浓度5.00 molL1，于30 C下，蓝光(450460 nm)照射搅拌反应1 h(图1)。再用FAD标准曲线测定酶浓度14、内标法测定反应转化率，并计算反应的转化数(TON)。1.3 解决问题的方法和思路解决问题的方法和思路 为了让学生更直观地感受酶的理性改造和光酶催化的优越性，并让实验更适合本科教学，我们设计了以野生型酶(WT-CvFAP)或突变体酶(V453E-CvFAP)为催化剂，以油酸或反油酸为反应底物的教学实验。本实验为24 h化学生物学实验或综合化学实验，具体安排如表1、图2所示。No.4 doi:10.3866/PKU.DXHX202210002 245 图图1 反应总括示意图反应总括示意图 表表1 实验课时安排实验课时安排 课时 实验内容 第一次课 8 h 1)接种WTCvFAP、V453ECvFAP菌种、扩大培养、诱导表达；2)使用AutoDock分子对接，理解突变位点的选择；3)菌体收集 第二次课 8 h 1)获得粗酶溶液；2)用FAD辅基定量分析酶浓度；3)光酶反应，并使用GC-MS进行表征 第三次课 8 h 1)绘制底物标准曲线，计算转化率；2)自主探索实验条件对结果的影响；3)对实验结果和分子对接结果分析讨论 图图2 实验流程图实验流程图 2 实验部分实验部分 2.1 实验目的实验目的 1)接触化学生物学前沿理论与技术，了解酶的理性改造，学习分子对接；2)了解光酶催化，学习脂肪酸光脱羧酶催化脱羧的方法；3)学习FAD辅基定量分析酶浓度、内标法定量反应转化率、TON衡量酶活性等。246大 学 化 学Vol.382.2 实验原理实验原理 脂肪酸光脱羧酶CvFAP，可以将长链脂肪酸脱羧转化为相应烃类，其催化活性依赖于黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅基。其机理是：在蓝光照射下，FAD吸收光子，激发态FAD与羧酸底物发生单电子转移，接着脱羧形成烷基自由基R、CO2、FAD，随后烷基自由基R进一步生成相应烷烃11。但野生型CvFAP对油酸和反油酸均具有较强催化脱羧效果。为了提高光脱羧酶的选择性，需要合理选择突变位点，对其进行理性改造。文献表明，将453位的缬氨酸突变为谷氨酸后，酶对反油酸的结合能力增强而对油酸的结合能力下降3，从而能实现对反式脂肪酸的选择性脱羧。反应方程式如图3所示。图图3 反应式反应式 2.3 实验步骤实验步骤 2.3.1 TB培养基制备培养基制备(1)称量2.40 g胰蛋白胨，4.80 g酵母粉，0.80 mL甘油，2.46 g K2HPO43H2O，0.44 g KH2PO4，加水定容至200 mL。摇动容器使溶质完全溶解，分装在两个500 mL摇菌瓶中。(2)将上述溶液于0.1 MPa高压下蒸汽灭菌20 min，备用。2.3.2 接种接种WT-CvFAP、V453E-CvFAP菌种菌种(1)取两个10 mL细胞培养管，标为WT-CvFAP、V453E-CvFAP。在超净工作台进行无菌操作：向每个细胞培养管内移取4 mL LB培养基，4 L 50 mgmL1卡那霉素溶液(1:1000)，80 L对应菌种(1:50)。(2)将细胞培养管置于37 C 200 rpm摇床中摇动生长16 h。2.3.3 扩大培养、诱导表达扩大培养、诱导表达(1)取出已配制好的TB培养基，分别标明WT-CvFAP和V453E-CvFAP，再各加入100 L 50 mgmL1卡那霉素溶液(1:1000)。(2)取出含有活化菌种的LB培养基，分别取2 mL加入对应TB培养基中，在37 C、220 rpm摇床中生长34 h，至OD600达到0.60.8。(