芦丁对湖羊乳腺氧化应激相关...子2信号通路基因表达的影响_丁红研.pdf

动物营养学报，（）：芦丁对湖羊乳腺氧化应激相关指标及核因子 相关因子 信号通路基因表达的影响丁红研 李 玉 赵 畅 冯士彬 王希春 汤继顺 吴金节（安徽农业大学动物科技学院，合肥；安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，合肥）摘 要：本试验旨在研究饲粮中添加芦丁对产后湖羊乳腺氧化应激相关指标及核因子 相关因子（，基因为）信号通路基因表达的影响。选取体重相近且分娩日期相近的湖羊 只，随机分为 组，每组 只。对照组饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加 和 芦丁的饲粮。预试期 ，正试期 。结果表明：）与对照组相比，饲粮中添加 芦丁能够减少湖羊乳腺腺泡内炎性细胞数量，芦丁组湖羊乳腺腺泡内未见炎性细胞。）与对照组相比，饲粮中添加 芦丁显著或极显著提高乳腺组织中过氧化氢酶（）（）和谷胱甘肽过氧化物酶（）（）活性以及总抗氧化能力（）（），饲粮中添加 和 芦丁极显著降低过乳腺组织中过氧化氢（）含量（）。）与对照组相比，饲粮中添加 芦丁极显著提高乳腺组织细胞内 的蛋白表达水平（），显著提高乳腺组织中 相对表达量（），显著降低乳腺组织中 样 关联蛋白（）相对表达量（）。）与对照组相比，饲粮中添加 芦丁显著提高乳腺组织中谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基（）相对表达量（）；饲粮中添加 芦丁显著或极显著提高乳腺组织中（）、（）、硫氧还蛋白（）（）、铁蛋白重链（）（）、转醛醇酶（）（）、苹果酸酶（）（）和血红素氧合酶（）相对表达量，显著提高乳腺组织中 淋巴细胞瘤（）相对表达量（）。由此可见，饲粮中添加 和 芦丁能够减少湖羊乳腺腺泡内炎性细胞数量，并发挥抗氧化应激作用，通过调节 信号通路的基因表达水平，改善产后湖羊乳腺的健康状态。关键词：湖羊；芦丁；乳腺组织；抗氧化；信号通路中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：安徽省自然科学基金优青项目（）；动物营养调控与健康安徽省重点实验室开放课题（）；安徽省重点研究与开发计划面上攻关项目（）作者简介：丁红研（），女，河北任丘人，博士研究生，从事反刍动物营养与代谢病研究。：通信作者：吴金节，教授，博士生导师，：围产期是反刍动物最关键的时期，此阶段反刍动物会经历包括能量负平衡的发生、肝功能紊乱、全身性的炎症反应以及氧化应激等在内的一系列巨大的生理变化。其中，氧化应激能够引起细胞、蛋白质以及脂质分子的氧化，从而导致组织损伤。近十年的研究表明，反刍动物围产期普遍经历不同程度的氧化应激，并且氧化应激与围产期疾病的发生发展存在着密切的关系。因此，做好反刍动物围产期的抗氧化管理至关重要。芦丁（）又称芸香苷、维生素 等，是广泛动 物 营 养 学 报 卷存在于植物根、茎叶、花、果实和种子中的一种黄酮类化合物，具有广泛的生物学活性，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保肝护肾及保护神经等。芦丁大部分生物活性主要归因于其有效的抗氧化特性，尤其是作为自由基清除剂的能力。研究表明，芦丁可以通过降低细胞内活性氧（）等自由基水平，降低细胞内炎症以及凋亡相关因子的表达，从而起到抗炎和组织保护等作用。也有研究发现，饲粮中添加芦丁能够改善反刍动物能量代谢并提高其生产性能。对奶牛乳腺上皮细胞的研究发现，芦丁能够提高细胞的抗氧化能力，抑制细胞的凋亡。本实验室的前期研究发现，芦丁能够降低湖羊血液内氧化应激状态，改善乳腺组织内炎症及凋亡情况。综上所述，芦丁对乳腺组织具有潜在的生物学影响。核 因 子 相 关 因 子 （，基 因 为）是属于（）调节蛋白家族的一种转录因子，被认为是细胞防御和抗氧化的关键调节因子。在体外培养的乳腺上皮细胞中，几种植物提取的抗氧化剂可以通过提高 的表达，触发抗氧化基因的转录，从而影响细胞的氧化应激状态。补充蛋氨酸能够通过提高乳腺组织中 以及其下游抗氧化相关靶基因 的表达，从而影响乳腺组织的氧化应激状态。综上所述，无论在体内还是体外，均参与了乳腺的抗氧化反应的调控。由此可见，作为一种转录因子，在调节乳腺细胞抗氧化基因 的表达中起着关键作用。基于以上结果，我们提出假设，芦丁除了有利于全身氧化应激状态和生产性能外，也能够通路调节 以及下游抗氧化基因 的表达，调节湖羊乳腺的氧化应激状态。因此，本试验开展芦丁对产后湖羊乳腺组织中氧化应激相关指标和 通路相关基因的影响，为芦丁作为一种绿色抗氧化剂在反刍动物生产中应用提供一定的理论依据。材料与方法 试验材料 试验所用芦丁购自于青岛某制药有限公司，纯度。试验设计及饲养管理 试验选择 月龄位于围产期的经产母羊 只，体重为（），随机分为 组，每组 只，每组分 栏饲养。对照组饲喂基础饲粮，试验 组 分 别 饲 喂 在 基 础 饲 粮 中 添 加 和 芦丁的饲粮。精料每日每只母羊，粗料不限，饲粮营养水平见表。将芦丁与精料混匀后，于晨饲先喂，然后再喂粗料。饲养试验于 年 月在安徽省马鞍山市金农牧业有限公司湖羊养殖场进行，预试期 ，正试期，为产前 至产后 。每天饲喂 次，分为：和：，自由采食，自由饮水。其他饲养管理按照养殖场规定进行。表 饲粮营养水平（风干基础）（）项目 精料 粗料 粗蛋白质 钙 磷 粗脂肪 干物质 酸性洗涤纤维 中性洗涤纤维 样品采集与指标检测 乳腺组织采集 参考尹清艳的方法于产后 晨饲前，每栏随机选取 只母羊屠宰，采集乳腺组织，每组总共屠宰 只母羊。将一部分乳腺组织固定于多聚甲醛溶液中，用于后续乳腺组织形态观察和免疫组化观察；另一部分立即放置于液氮中冻存，之后转移至 冰箱冻存，待测乳腺组织相关指标。期丁红研等：芦丁对湖羊乳腺氧化应激相关指标及核因子 相关因子 信号通路基因表达的影响 乳腺组织病理学观察 按照石蜡切片的制作流程对固定好的乳腺组织进行石蜡切片制作，对制作好的切片进行苏木精伊红（）染色，中性树脂封片，然后在显微镜下观察各组乳腺组织的病理学变化。乳腺组织中氧化应激相关指标的检测 参考尹清艳的方法从 冰箱中取出乳腺组织，于干冰上取 左右乳腺组织样品，采用酶联免疫吸附试验（）法检测乳腺组织总抗氧化能力（）和过氧化氢酶（）、谷胱甘肽过氧化物酶（）、超氧化物歧化酶（）活 性 以 及 过 氧 化 氢（）、丙 二 醛（）含量等。免疫组化 使用防脱载玻片制作石蜡切片，对制作好的石蜡切片进行免疫组化染色，抗体孵育完成后进行常规封片，晾干后在高倍显微镜下观察，蛋白的阳性反应呈棕黄色圆点状，随机选取视野拍照，使用 软件计算各组阳性表达的光密度值并进行分析。信号通路相关基因表达的检测 参考 等的方法从 冰箱中取出乳腺组织，使用 提取，检测提取的 浓度后，进行反转录，具体步骤参照 （）试剂盒说明书进行；以反转录得到的 为模板，以肌动蛋白（）为内参采用实时荧光定量（）方法检测乳腺组织中 以及其他氧化应激相关基因的表达，具体操作由安徽欣乐生物技术有限公司完成。采用 软件，根据 提供的绵羊源序列设计引物，具体基因及引物序列见表。反应体系如表 所示，反应条件为：预变性 后，进行 反应，、，、，个 循 环。使 用法计算目的基因的 相对表达量。表 引物序列 基因名称 引物序列 （）产物长度 淋巴细胞瘤 ：谷胱甘肽还原酶：谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基：谷胱甘肽过氧化物酶：谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基：苹果酸酶 ：转醛醇酶 ：硫氧还蛋白：硫氧还蛋白还原酶：铁螯合酶：血红素氧合酶 ：动 物 营 养 学 报 卷续表 基因名称 引物序列 （）产物长度 铁蛋白重链 ：铁结合核蛋白：醌氧化还原酶 ：核因子 相关因子 ：样 相关蛋白 ：泛素连接酶 ：核转录因子 ：丝裂原活化蛋白激酶 ：丝裂原活化蛋白激酶 ：丝裂原活化蛋白激酶 ：视黄醇类 受体 ：肌动蛋白：表 反应体系 体系 体积 上游引物 （）下游引物 （）总计 数据统计与分析 试验数据采用 进行初步整理，采用 软件进行单因素方差分析（），采用 法进行多重比较，结果以“平均值标准误”表示，表示差异极显著，表示差异显著。结果与分析 芦丁对湖羊乳腺组织学变化的影响 如图 所示，各组湖羊乳腺组织均可观察到完整的细胞形态和结构，细胞核清晰，腺泡完整。对照组乳腺可见少量炎性细胞浸润，但无明显病理特征；与对照组相比，芦丁组腺泡内炎性细胞明显减少，芦丁组腺泡内未见炎性细胞，且细胞凸起形成的乳头较多，说明乳腺上皮细胞较多。芦丁对湖羊乳腺组织中氧化应激相关指标的影响 由图 可知，与 对 照 组 相 比，饲 粮 中 添 加 芦丁能够极显著降低湖羊乳腺组织中 的含量（），对乳腺组织中其他氧化应激指标未见显著影响（）；饲粮中添加 芦丁能够极显著降低湖羊乳腺组 期丁红研等：芦丁对湖羊乳腺氧化应激相关指标及核因子 相关因子 信号通路基因表达的影响织中 的含量（），显著或极显著提高乳腺组织中（）和（）的活性以及（）。图 芦丁对湖羊乳腺组织病理变化的影响 （）与对照组相比，表示差异显著（），表示差异极显著（）。下图同。，（），（）图 芦丁对湖羊乳腺组织中氧化应激相关指标的影响 芦丁对湖羊乳腺组织中 表达的影响 由图 可知，与 对 照 组 相 比，饲 粮 中 添 加 芦丁能够极显著提高湖羊乳腺组织细胞内 的蛋白表达水平（），且 多集中于细胞核内；饲粮中添加 芦 丁 能 够 显 著 提 高 乳 腺 组 织 中 相对表达量（），显著降低乳腺组织中 样 相关蛋白（）相对表达量（），对乳腺组织中泛素连接酶（）相 对 表 达 量 无 显 著 影 响（）。芦丁对湖羊乳腺组织中 信号通路相关基因表达的影响 由图 可知，与 对 照 组 相 比，饲 粮 中 添 加 芦丁显著提高湖羊乳腺组织中谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基（）相对表达量（），对其他 信号通路相关基因的 相对表 达 量 未 见 显 著 影 响（动 物 营 养 学 报 卷）；饲粮中添加 芦丁显著或极显著提高乳腺组织中（）、（）、硫氧还蛋白（）（）、铁蛋白重链（）（）、转醛醇酶（）（）、苹果酸酶（）（）和血红素氧合酶（）相对表达量，对谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（）、谷胱甘肽还原酶（）、铁螯合酶（）和醌氧化还原酶（）相对表达量未见显著影响（）。图放大比例为。图 芦丁对湖羊乳腺组织中 表达的影响 芦丁对湖羊乳腺组织中其他通路蛋白基因表达的影响 由图 可知，与对照组相比，试验组湖羊乳腺组织中核转录因子（）、丝裂原活化蛋白激酶（）、丝裂原活化蛋白激酶（）、丝裂原活化蛋白激酶（）和视黄醇类 受体（）相对表达量虽有变化趋势，但差异均不显著（）；饲粮中添加 芦丁显著提高乳腺组织中 淋巴细胞瘤（）相对表达量（）。讨 论 围产期是反刍母畜繁殖周期内内分泌和代谢变化最为显著的时期，这一阶段能量需求增加，代谢增强，极易产生能量负平衡现象。能量负平衡引起过量的脂肪发生动员，这可能会产生大量的。过量的 使机体的正常氧化还原反应失衡，损害生理进程，如导致细胞损伤和功能障碍等，引起围产期母畜发生氧化应激。乳腺作为哺乳动物泌乳的组织器官，其良好的发育以及健康的状态直接影响着泌乳性能和乳汁成分。氧化应激是影响哺乳动物乳腺健康的主要因素之一。对小鼠的研究表明，饲粮中添加芦丁能够防止脂多糖（，）诱导的乳房炎的发生。因此，本试验中，我们以围产期湖羊的乳腺组织为研究对象，以芦丁为外源抗氧化补充剂，研究饲粮中添加芦丁对围产期湖羊乳腺氧 期丁红研等：芦丁对湖羊乳腺氧化应激相关指标及核因子 相关因子 信号通路基因表达的影响化应激相关指标及 信号通路基因表达的影响。图 芦丁对湖羊乳腺组织 信号通路相关基因表达的影响 动 物 营 养 学 报 卷图 芦丁对湖羊乳腺组织中其他通路蛋白基因表达的影响 、和 等抗氧化酶的活性是评定机 体 抗 氧 化 能 力 的 重 要 指 标。等研究发现，芦丁能够通过调节沉默信息调节因子 相关酶（）通路提高、活性，并降低 含量，从而减轻心肌损伤。芦丁单体形式的槲皮素能够显著降低 小鼠大脑内的 含量以及 活性，显著降低锰金属诱导的细胞内、含量，显著提高、活性以及谷胱甘肽（）含量。李敏研究表明，芦丁能够提高心肌成纤维细胞 活性，降低 含量。在本试验中，饲粮中添加 芦 丁 显 著 提 高 了 湖 羊 乳 腺 组 织 中、活性以及，虽然 活性未见显著变化，但也表现出一定的升高趋势，含量有一