狂犬病病毒感染改变小鼠To...样受体及相关细胞因子的表达_衣惠鑫.pdf

吉林农业大学学报 2023，45（1）：121-126http:/Email:jlndxb Journal of Jilin Agricultural University狂犬病病毒感染改变小鼠Toll样受体及相关细胞因子的表达*衣惠鑫1，2，张健2，张岩2，霍明赫2，冯烨2，涂长春1，2，刘艳2*1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2.军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病防控重点实验室，长春 130122摘 要：Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）作为重要的固有免疫相关受体，在不同毒力狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）感染的鼠脑中发生了怎样的变化，目前尚未见具体的报道。因此使用不同RABV毒株（固定毒株CVS-11、街毒株GDMM、弱毒株SRV9）经颅内接种构建小鼠感染模型，并利用RT-qPCR、Western blot等方法探究小鼠脑内 TLRs（TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9）、下游效应分子（IRF3、Irgm1）及相关细胞因子（IL-1、IFN-、IFN-和IFN-）的表达改变。结果显示：CVS-11组与GDMM组相关指标的改变相类似，鼠脑内病毒拷贝数随感染时间的增加而升高，TLR2、TLR8、TLR9、Irgm1及IFN-、表达显著上调，小鼠分别在感染后7，12 d（中位数）死亡；SRV9组的病毒拷贝数在感染后期显著下降，TLR7、TLR8、TLR9和IFN-的变化与病毒拷贝变化趋势一致，IFN-无变化，小鼠未发生死亡。说明 TLR2、TLR7、TLR8、TLR9参与RABV感染后的免疫调控，其中，TLR7的抗病毒作用更为重要，但其具体发挥的作用及作用机制，还有待于进一步研究。关键词：狂犬病病毒；小鼠感染模型；固有免疫受体；Toll样受体；免疫应答中图分类号：S852.65 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2023）01-0121-06DOI：10.13327/j.jjlau.2020.1024引用格式：衣惠鑫，张健，张岩，等.狂犬病病毒感染改变小鼠Toll样受体及相关细胞因子的表达 J.吉林农业大学学报，2023，45（1）：121-126.Expression of Toll-like Receptors and Related Cytokines in Rabies Virus Infected Mice*YI Huixin1，2，ZHANG Jian2，ZHANG Yan2，HUO Minghe2，FENG Ye2，TU Changchun1，2，LIU Yan2*1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Prevention and Control，Military Veterinary Institute/Academy of Military Medical Sciences，Academy of Military Sciences，Changchun 130122，ChinaAbstract：Toll-like receptor(TLRs)is an important innate immune receptor.So far,no specific report has been found on the changes of TLRs in the brains of mice infected with rabies virus(RABV)of different virulence.In this study,we used three RABV strains(fixed strain CVS-11,street strain GDMM and attenuated strain SRV9)to construct infected mouse models via intracranial injection,then RT-*基金项目：国家自然科学基金项目（31972720）作者简介：衣惠鑫，女，在读硕士，研究方向：分子病毒学。收稿日期：2021-01-12*通信作者：刘艳，E-mail：吉林农业大学学报 2023 年 2 月Journal of Jilin Agricultural University 2023，FebruaryqPCR and WB were performed to examine the alteration of TLRs(TLR2,TLR3,TLR4,TLR7,TLR8 and TLR9),downstream effector molecules(IRF3,Irgm1),as well as TLRs related cytokines(IL-1,IFN-,IFN-and IFN-)in mouse brains.The results demonstrated that TLR2,TLR8,TLR9,Irgm1 and IFN-,were significantly up-regulated in CVS-11 and GDMM infected group,accompanied with the increasing viral copies from 3 d to 5 d,and the mouse died at 7 dpi.and 12 dpi.,respectively.Whereas,the viral copies of SRV9 began to decrease at late stage,meanwhile,the alteration of TLR7,TLR8 and TLR9 were similar to that of viral copies,and this strain was not lethal to mice.These results indicated that TLR2,TLR7,TLR8 and TLR9 are involved in RABV induced immune response,among which the antiviral effect of TLR7 is more important,however,its specific role and mechanism need to be further studied.Key words：rabies virus；mouse infection model；innate immune receptor；Toll-like receptor（TLRs）；immune response狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）是典型的嗜神经性病毒，病毒粒子呈子弹状，是有囊膜不分节段的单股负链RNA病毒，可经中枢神经系统逆行侵入宿主大脑，引起温血动物的脑脊髓炎，一旦发病，病死率高达100%。目前，尚无有效治疗方法，暴露前或暴露后接种狂犬疫苗是唯一有效的预防手段。固有免疫是机体产生免疫反应、防御病原微生物的第一道防线。固有免疫细胞通过表达特定的 模 式 识 别 受 体（Patern recognition receptors，PRRs）识别特定病原体，引发炎症反应进而有效清除病原。PRRs 主要包括两大类：Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）和 RIG-样 受 体（RIG-like receptors，RLRs）1。TLRs 属型跨膜受体，通过募集中性粒细胞和吞噬细胞，释放炎症因子（如白介素等）来清除病原。TLRs在人和小鼠中分别包括10个和13个家族受体，根据识别病原体相关的分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）的性质及配体类型分成两类，一类主要分布于细胞膜上，包括：TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6 和 TLR11，识别脂质和微生物的膜成分；另一类包括TLR3、TLR7、TLR8和TLR9，定位于内质网和核内体，识别核酸2。通常情况下，TLR3识别双链 RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）病毒基因组或单链 RNA 病毒复制过程所产生的dsRNA3。TLR4、TLR7和TLR8可识 别 埃 博 拉 病 毒 等 多 种 病 毒 产 生 的 单 链RNA4-5，TLR9则能直接识别EBV、HPV等游离在细胞浆内的DNA病毒核酸6-7，TLR2可以参与流感病毒的免疫识别8。但RABV感染小鼠后，鼠脑内TLRs及相关细胞因子的改变尚未见详细的报道。本研究通过多种方法验证TLRs及相关细胞因子在不同毒力 RABV 感染小鼠后的表达变化，为阐明不同毒株感染小鼠后TLRs介导的免疫应答，以及不同毒株的致病机制提供一定的研究基础。1材料与方法1.1细胞株与病毒BHK-21（仓鼠肾细胞）、RABV 固定毒株CVS-11、街毒株GDMM（分离自2016年广东茂名伤人犬）、弱毒株SRV9，均由吉林省人兽共患病防控重点实验室保存。1.2试验动物SPF级昆明雌性青年鼠（体质量122 g）购自辽宁长生生物技术股份有限公司。1.3主要试剂与耗材胎牛血清（FBS）和 MEM 细胞培养液购自Corning（美国）公司；青链霉素混合液（双抗）购自Hyclone（美国）公司；0.25%Trypsin-EDTA 购自Gibco（美国）公司；FITC标记抗RABV核蛋白单克隆抗体购自FUJIREBIO（美国）公司；PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）、TB Green Fast RT-qPCR Mix 购自 TaKaRa（中国大连）公司；TRIzol购自Thermo Fisher（美国）；RIPA Lysis Buffer购自Millipore（美国）公司；TLRs抗体购自CST（美国）公司。1.4RABV毒株滴度测定将 RABV 固定毒株 CVS-11、街毒株 GDMM和弱毒株 SRV9等 3种毒株分别接种 BHK-21细122衣惠鑫，等：狂犬病病毒感染改变小鼠Toll样受体及相关细胞因子的表达吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University胞，来测定病毒滴度，病毒滴度测定参照吉林省人兽共患病防控重点实验室之前建立的方法进行9。1.5RABV毒株感染鼠脑的制备将小鼠随机分为CVS-11、GDMM与SRV9攻毒试验组和对照组，每组6只。乙醚麻醉后，按照1107 TCID50/mL 进行颅内注射细胞毒 30 L，对照组注射同体积无血清MEM培养液。每日观察小鼠体质量及临床症状，分别收集对照组（ck）、CVS-11组和GDMM组第3天和第5天（CVS-3d、CVS-5d、GDMM-3d、GDMM-5d）、SRV9 组第 5 天和第9天的脑组织（SRV9-5d、SRV9-9d），称重后根据脑组织重量加适量PBS制备30%匀浆，离心取上清备用。1.6总RNA的提取及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）取100 L鼠脑研磨上清，用TRIzol法提取总RNA，反转录获得cDNA，RT-qPCR进行绝对荧光定量与相对荧光定量分析，引物序列见表1。反应条件：95 30 s；95 5 s，60 30 s 共 40 次循环。1.7Western blot分析取上述鼠脑组织，每个样品加入 200 L 1RIPA于冰上裂解30 min，1.2万 g离心15 min，吸取上清。Bradford法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸处理10 min，每孔上样40 g进行蛋白电泳，转印至NC