2022年医学专题—第六章-动植物细胞培养.ppt

生物(shngw)反应工程原理,李艳 教授(jioshu)生物科学与工程学院,第一页，共八十页。,第六章 动植物细胞培养,动植物细胞培养技术：将动植物组织、器官在适当的培养基上进行离体培养的技术。组织：指由结构和功能相似的细胞和细胞间质组成，具有一定形态和生理功能的聚集体。器官：指机体中具有特殊结构和完成特殊功能的分化部分。组织与器官培养：在人工条件下，使它们(t men)得以继续生存或发展的一种培养方法。,第二页，共八十页。,第一节 动植物细胞培养的特性(txng),一、动物细胞培养的特性技术发展(fzhn)历史：1907年，美国，Harrison首次将蛙的神经组织在试管内培养成功。1950年，Enders及同事发表第一篇在培养细胞中生长病毒的报告。1972年，Knazek等创立中空纤维细胞培养技术，使细胞体外培养扩展为大规模培养。1986年，Demo生物公司用微囊化技术大规模培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体获得成功。随后，动物细胞培养技术日趋完善。,第三页，共八十页。,与微生物培养(piyng)相比动物细胞培养(piyng)特性：,1、动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；2、生长速度缓慢，易受微生物污染(wrn)，培养时需要抗生素。大多数哺乳动物细胞需附着在固体或半固体的表面才能生长；3、对营养要求严格；4、大规模培养时，不可简单地套用微生物培养的经验。5、动物细胞培养基配方复杂，需补充血清和蛋白胨。,第四页，共八十页。,大规模细胞培养的主要(zhyo)危害是微生物污染。,设备、培养基、悬浮系统和操作方法等的复杂性是引起微生物污染的主要原因。支原体的感染能力强，且不易检出，对动物细胞培养的威胁最大。大规模细胞培养需要(xyo)有一个设备精良的细胞库（cell bank）。动物细胞的脆性是导致培养控制复杂化的关键。,第五页，共八十页。,第六页，共八十页。,动物(dngw)细胞培养过程中的特征：,生长速度慢，易受微生物污染，但可采用在培养过程中加入抗生素等措施来解决。细胞个体大且无壁，对环境敏感，因此应慎重解决供氧（搅拌与通风）与细胞脆弱的矛盾。设备放大是一新(y xn)课题，不能完全按照微生物反应过程的经验。反应过程成本高，主要用于高附加值产物的生产。,第七页，共八十页。,二、植物(zhw)细胞培养特性,植物细胞培养发展(fzhn)历史1902年，出生于奥地利的德国植物学家G.Haberlandt预言植物细胞培养的可能性。1937年，法国和美国科学家成功进行胡萝卜和烟草的组织培养。1954年，Muir等第一次进行植物细胞悬浮培养。1966年，Klein指出利用植物细胞培养生产生化产品。,第八页，共八十页。,与微生物相比植物细胞(xbo)的特性：,1、细胞个大，细胞壁以纤维素为主要成分，耐拉不耐扭，抗剪切能力低。2、生长速率慢，为防止培养过程中染菌，需加抗生素。3、细胞培养需氧，但培养液黏度大，且不能强力通风(tng fng)搅拌。4、产物在细胞内，且产量低。5、培养中细胞常生长成各种大小的团块，增加了悬浮培养的难度。,第九页，共八十页。,植物(zhw)细胞培养的工业化产品：,朝鲜参皂角苷、桉树油、生物碱等。兰花等名贵花卉、紫杉醇等植物细胞培养技术：诱导子、前体饲喂、两相法培养(piyng)、质体转化、毛状根、冠瘿瘤组织培养(piyng)，固定化技术。,第十页，共八十页。,第二节 动物细胞大规模培养(piyng),一、动物细胞的形态(xngti)二、动物细胞培养基三、动物细胞培养方法四、动物细胞培养技术和工艺,第十一页，共八十页。,一、动物细胞的形态(xngti),1、成纤维细胞型2、上皮细胞型3、游走(yu zu)细胞型4、多形性细胞型5、悬浮型细胞,第十二页，共八十页。,1、成纤维细胞型,这种细胞形态(xngti)与体内成纤维细胞形态(xngti)相似故而得名。细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆形核，胞质向外伸出23个长短不同的突起。如血管内皮、心肌、平滑肌、成骨细胞等。,第十三页，共八十页。,2、上皮细胞型,细胞呈扁平的不规则三角形，中央有圆形核，生长(shngzhng)时常彼此紧密连接单层细胞片，起源于外胚层和内胚层组织的细胞，如皮肤表皮及衍生物（汗腺、皮脂腺等）。肠管上皮、肝、胰和肺泡上皮细胞。,第十四页，共八十页。,3、游走(yu zu)细胞型,细胞的培养需要在支持物上生长，一般不连接成片，细胞胞质经常出现伪足和突起，呈活跃的游走和变形运动，速度快而且(r qi)方向不规则。,第十五页，共八十页。,4、多形性细胞(xbo)型,除上述三种细胞外，还有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定它们的稳定(wndng)形态，可统归多形性细胞。,第十六页，共八十页。,5、悬浮(xunf)型细胞,这类细胞常呈圆形，不贴附在支持物上，呈现悬浮状态生长。如血液细胞，淋巴组织细胞及肿瘤(zhngli)细胞。培养这类细胞也可采用微生物培养的方法进行悬浮物培养。,第十七页，共八十页。,二、动物细胞培养基,1、动物细胞培养的环境(hunjng)要求2、培养基组成3、常用的合成培养基4、培养基制备应考虑的因素,第十八页，共八十页。,1、动物(dngw)细胞培养的环境要求,温度来源不同(b tn)的动物细胞，其最适的生长温度是不尽相同的，昆虫细胞的最适温度是 2528，人和哺乳动物细胞的最适温度37。鸟类细胞在38.5时生长最佳。动物细胞对低温的耐受力比对高温的耐受力强，如温度升至45时，1h内人和哺乳动物细胞将被杀死；相反，降低温度把细胞置于2535时，细胞仍能生长，但速度减慢，并维持长时间不死。,第十九页，共八十页。,pH值动物细胞合适的pH值一般在7.27.4，低于6.8或高于7.6时都对细胞产生不利的影响，严重时可导致细胞退变或死亡。原代培养细胞对pH值的变化耐受性差，传代(chun di)细胞对pH值变化的耐受性较强。对于大多数细胞来说，偏酸性环境比碱性环境更有利于细胞的生长。,第二十页，共八十页。,营养成分营养物质包括碳源、氮源、氨基酸、无机盐、微量元素、生长因子等。渗透压等其它因素渗透压对动物细胞也有影响(yngxing)。其他因素如血清、剪切力等对细胞也有很大的影响(yngxing)。,第二十一页，共八十页。,支持物体外培养(piyng)的大多数动物细胞需在人工支持物上单层生长，常用支持物有：玻璃、塑料制品、微载体（聚苯乙烯、交联葡萄糖、聚丙烯酰胺、纤维素衍生物、几丁质、明胶等）。气体氧气：气相中最重要的成分是氧气和二氧化碳。大多数动物细胞培养适合于大气中的氧含量或更低些。据报道，对培养基硒含量的要求与氧浓度有关，硒有助于除去呈自由基状态的氧。在大规模细胞培养中，氧可能成为细胞密度的限制因素。,第二十二页，共八十页。,CO2：气相中的CO2浓度直接调节溶解态CO2的浓度，溶解态的CO2受温度影响，CO2溶于培养基中形成H2CO3，它又能再解离：由于HCO3-与多数阳离子的解离数很小，趋于结合态，故使培养基变酸。提高(t go)气相中CO2 含量的结果是降低培养液pH值，,第二十三页，共八十页。,2、培养基的组成(z chn),培养基是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是组织细胞培养最重要的条件。用于动物细胞培养的培养基可以分为天然培养基和合成培养基两大类。天然培养基：是使用最早、最为有效的动物细胞培养基，它主要取自于动物体液或从动物组织分离提取而得，其优点是营养成分丰富、培养(piyng)效果良好；缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。,第二十四页，共八十页。,天然培养基的种类很多，包括生物性体液（如血清）、组织浸出液（如胚胎浸出液）、凝固剂（如血浆）等。血清：组织培养中最常用的天然培养基是血清，血清中含有包括大分子的蛋白质和核酸等丰富的营养物质，对促进细胞生长繁殖、黏附及中和某些物质的毒性(d xn)起着一定的作用。用于组织培养的血清种类很多，其来源主要是动物，有小牛血清、胎牛血清、马血清、兔血清以及人血清等，最广泛使用的是小牛血清和胎牛血清。,第二十五页，共八十页。,血浆：血浆不仅可用来支持培养组织块，而且还供给细胞生长的营养物质，但由于血浆很容易发生液化，目前已很少单独使用(shyng)。一般使用(shyng)的是禽类血浆。组织浸出液：组织浸出液常用的是胚胎浸出液（如鸡胚浸出液），它的主要成分含有大分子的氨基酸，有促进细胞生长的作用。水解乳蛋白：是常用的一种天然培养基，是由乳白蛋白经水解而制得，氨基酸的含量较高。一般配制成0.5%的溶液，或与合成培养基以1：1共同使用。,第二十六页，共八十页。,合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体内生存环境中各种已知物质在体外人工条件的模拟，经过反复实验(shyn)筛选、强化和重新组合后形成的培养基。合成培养基的种类虽然很多，但一般都含有氨基酸、维生素、糖类、无机离子和一些其他辅助性成分。氨基酸：是合成培养基的主要成分，合成培养基中的氨基酸是以必需氨基酸为主。几乎所有的细胞对谷氨酰胺都有较高的要求。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质。,第二十七页，共八十页。,维生素：是维持细胞生长的一种生物活性物质，它们在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞的代谢有重大的影响。糖类(tn li)：多数合成培养基都含有葡萄糖，它主要由糖酵解作用代谢形成丙酮酸，并可转化乳酸或乙酰乙酸进入柠檬酸循环形成CO2。对胚胎细胞和转化细胞，乳酸在培养基中的积累特别明显。无机离子：是细胞的重要组成部分之一，参与了细胞的代谢活动。培养基中的无机离子除K+、Na+等外，还含有Fe2+、Zn2+、Cu2+等微量离子。,第二十八页，共八十页。,其他成分：在一些合成培养基中还含有一些代谢的中间产物、氧化(ynghu)还原剂、三磷酸腺苷、辅酶A等成分。尽管现在的合成培养基成分和含量已经较为复杂，但仍然不能完全满足体外培养细胞生长的需要，合成培养基中还是需要加入一定量的天然培养基予以补充。,第二十九页，共八十页。,3、常用(chn yn)的合成培养基,目前合成培养基的种类已有数十种，大多数培养基都是为适应某种组织细胞的生长而在某种合成培养基的基础上改良而来的。目前较为(jio wi)常用的有199培养液、Eagle（MEM、DMEM）培养液、RPMI1640培养液、HAM培养液等。,第三十页，共八十页。,第三十一页，共八十页。,无血清培养基一般由基础培养液和替代血清的补充因子组成：基础培养基：是各种营养物质的混合物，是维持组织或细胞生长、发育、遗传、繁殖等一系列生命活动比不可少的物质，基础培养基的成分是完全已知的，而且可以按照细胞的不同营养要求增加或减少某些(mu xi)组分。补充因子：是用来替代血清的各种因子的总称。其种类很多，包括大分子、小分子物质和微量元素等。补充因子又可分为必需补充因子和特殊补充因子。,第三十二页，共八十页。,三类(sn li)无血清培养基：,第三十三页，共八十页。,4、培养基制备(zhbi)应考虑的因素,（1）pH值：一般正常的成纤维细胞系以pH=7.47.7最好，转化细胞以7.07.4更合适，上皮细胞5.5合适。（2）缓冲能力：碳酸盐缓冲系统由于毒性小、成本低，对培养物有营养作用，因此比其他缓冲系统用得多。但在生理pH值条件下的缓冲能力差。（3）渗透压：一般常用冰点降低(jingd)或蒸汽压升高测定。（4）黏度：培养基黏度受血清含量影响，在多数情况下，对细胞生长没有什么影响。,第三十四页，共八十页。,三、动物(dngw)细胞培养方法,第三十五页，共八十页。,1、悬浮(xunf)培养,悬浮培养是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程，主要用于非帖壁依赖性细胞的培养。悬浮培养对设备的要求(yoqi)简单，但是悬浮培养的细胞密度较低，转化细胞悬浮培养有潜在致癌危险，培养病毒易失去病毒标记而降低免疫能力。,第三十六页，共八十页。,2、贴壁培养,贴壁培养是指必须贴附在固体介质表面上生长的细胞培养，主要用于非淋巴组织和多异倍体等贴壁依赖性细胞的培养。由于(yuy)大多数动物细胞