金丝桃苷调控miR-375...轴影响脑缺血再灌注损伤研究_夏丽秀.pdf

生物信息学 ：网络首发 ：（）金丝桃苷调控 轴影响脑缺血再灌注损伤研究夏丽秀，肖瑞，郑莉（湖北省中西医结合医院老年病科，武汉 ）摘要目的研究金丝桃苷（）调控 趋化因子配体（）轴对脑缺血再灌注损伤（）的作用机制。方法采用生物信息学分析影响的潜在基因及 ，最终将 纳入研究。收集患者血浆用于检测 的表达，对细胞进行氧葡萄糖剥夺复氧（）处理，建立体外模型，检测细胞内 的表达。采用 试剂盒分析细胞活力，流式细胞术分析细胞凋亡程度，双荧光素酶报告试验分析 的调控关系。结果 在 患者血浆与 细胞模型中的表达异常升高（）。能抑制 在 细胞模型中的表达。能提高 细胞活力，抑制 诱导的细胞凋亡（）；过表达 能降低细胞增殖活力、增加凋亡（）。被证明是 的下游靶点，在患者血浆与 细胞模型中均表达降低（）。抑制 能部分逆转 作用，敲减 也能部分逆转 抑制剂的作用。结论 通过上调 抑制 对脑损伤起到保护作用。关键词金丝桃苷；脑缺血再灌注损伤；氧葡萄糖剥夺复氧 中图法分类号 文献标识码 文章编号 （），（，）（）（）（）（），（），（），（），（），（），；重庆医学 年月第 卷第期基金项目：湖北省自然科学基金项目（）。作者简介：夏丽秀（），主治医师，硕士，主要从事中医内科老年病相关研究。通信作者，：。脑缺血患者在临床上具有较高的致死率，脑缺血对中老年患者的健康造成严重威胁。再灌注治疗是一种能有效缓解脑缺血的技术，但是突然对脑组织血流量进行改善容易导致患者出现再灌注损伤，即缺血再灌注损伤（）。氧化应激诱导的细胞凋亡、细胞坏死等病理过程均参与 发展。开展 分子机制研究对于开发更多有效药物、识别新的生物靶点具有重要意义。金丝桃苷（）又名槲皮素吡喃半乳糖苷，属于黄酮醇苷化合物（化学结构式见图），具有抗炎、利尿、降血糖、保护心脑血管等作用。研究显示，能上调 的表达，保护缺氧诱导的心肌细胞损伤。有研究发现，通过一氧化氮信号通路减轻缺氧葡萄糖再灌注诱导的皮质神经元损伤。然而，对神经细 胞氧葡 萄 糖 剥 夺复 氧（）损伤的作用机制仍有待进一步明确。有研究表明，上调可通过抑制 ，减轻多巴胺能神经元的损伤。上调 被证实参与了毛蕊异黄酮对大鼠脑的保护作用。趋化因子配体（）是趋化因子的亚类，具有募集并激活白细胞的功能，参与多种疾病发展。皮质神经元来源的外泌体 通过下调缺血性脑损伤 大 鼠 星 形 胶 质 细 胞 来 抑 制 神 经 炎症。通过抑制 对脑微血管内皮细胞 诱导损伤发挥保护作用。本研究旨在探讨 在 中的作用，并结合生物信息学分析和细胞实验探究其在治疗中的潜在机制。图 化学结构式材料与方法材料 （，相对分子质量 ，纯度，中国 药 品 生 物 制 品 检 定 所），小 鼠 脑 神 经 瘤（）细胞（中国科学院上海细胞生物研究所），标准胎牛血清、细胞培养专用青链霉素混合液、细胞凋亡检测试剂盒、电化学发光（）超敏发光液（北京索莱宝科技有限公司），无糖、葡萄 糖 溶 液（武 汉 普 诺 赛 生 命 科 技 有 限 公 司），试剂盒、双荧光素酶基因检测试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司），全波长多功能酶标仪 美谷分子仪器（上海）有限公司，流式细胞仪（美国 公司），试剂、聚偏二氟乙烯（）膜（上海碧云天生物技术有限公司），实时聚合酶链式反应（）扩增仪 （美国 公司），第一链 合成试剂盒、（美国 公司），引物由南京金斯瑞生物科技股份有限公司 合 成，抗 、抗甘 油 醛磷 酸 脱 氢 酶（）、抗免疫球蛋白（英国 公司），（美国 公司）。过表达、敲减质粒与 模拟体与抑制剂（上海吉玛制药技术有限公司）。方法生物信息学分析从基因表达综合数据库 （：）中获得 相关芯片表达数据（），且对中差异表达的基因进行分析。使用 在 线 网 站（：）对基因进行 富集分析。网站（：）用于检索风险基因。网站（：）用于蛋白 互 作 用 分 析。在 线 网 站（：）用于对 进行 富集分析。在线网站（：）、在线网站（：）用于检索基因的上游靶标。临床样本收集 年月至 年月在本院治疗的 例 患者血浆，用于 表达检测。另外收集 例年龄与性别均匹配的健康志愿者血浆作为对照（）。所有血液样品均在液氮中保存备用。所有参与者均对本研究知晓并签署书面知情同意书。体外模型建立采用神经母细胞瘤细胞 建立细胞模型。处理：细胞在缺氧（、）的无糖培养基中孵育；用含有葡萄糖和 胎牛血清的 培养基替换无糖培养基，在常氧条件下再孵育。对 处理后的 细胞分重庆医学 年月第 卷第期别添加、的 进行处理以确定最佳使用浓度，细胞添加等量的二甲基亚砜（）。细胞转染构建 敲减（）及过表达（）质粒，分别以 与 作为对照，将以上质粒与 抑制剂（）及阴性对照（）转染至 细胞，转染过程按照 转染试剂盒说明书进行。检测细胞活力 细胞接种于 孔培养板，每孔 个细胞。分别在培养的、向每个培养孔中加入 的 试剂，再孵育后使用多功能酶标仪检测各孔吸光度值，检测波长为 。流式细胞术检测细胞凋亡收集 细胞，重悬，每管中加入 个细胞，分别使用 与 碘化丙啶（）进行避光染色，后通过流式细胞仪检测，分析细胞凋亡率。实时荧光定量 （）检测 的 表达采用 试 剂 提 取 血 浆 或 细 胞 的 总。逆转录试剂盒合成 。在实时 扩增仪 上使用 试剂盒进行 分析。使用 法计算 相对表达量，作为 的内参，作为 的内参。检测 的蛋白表达采用 裂解液裂解细胞，试剂盒测定蛋白浓度，行聚丙烯酰胺凝胶电泳（），将蛋白转移至 膜上。室温下使用脱脂牛乳封闭。下将膜与一抗 （）、（）过夜孵 育。之 后加 入 辣根过 氧化物 酶（）标记的二抗免疫球蛋白（）孵育。显影并借助 软件计算蛋白相对灰度值。双荧光素酶报告实验验证 和 的靶向关系合成 野生型（）与突变型（）的 端片段并克隆到荧光素酶报告载体，使用 将 、分别与 或 共转染至 细胞，在、含 的环境中培养。使用双荧光素酶检测试剂盒评估各组细胞的荧光素酶活性。统计学处理采用 软件进行统计学分析。数据以表示，检验和单因素方差分析法分别用于比较两组或多组数据差异。为差异有统计学意义。结果 对 处理的 细胞增殖和凋亡的影响与 细胞比较，细胞增殖活力被抑制，凋亡增加，而加入 后，细胞增殖活力有所改善、凋亡减少，且随 浓度的增加呈剂量依赖性（），见图。因 浓度的 对 细胞的影响最显著，因此将该浓度处理的细胞用于后续实验。：不同细胞增殖活力；：不同细胞凋亡率；：，与 比较；：，与 比较；：，与 比较。图 对 处理的 细胞增殖和凋亡的影响生物学分析结果 数据集中大脑中动脉闭塞（）模型大鼠中差异表达的基因，见图。对 组中表达上调的基因进行功能富集分析，结果显示，基因被富集在一条炎性通路（：）中。将该通路中富集的基因 、重庆医学 年月第 卷第期 、与 发病风险基因进行蛋白互作用分析，发现 其他基因具有较强关联。对 模 型 中 表 达 水 平 的影响与 比较，患者血浆中 的表达显著 增 强（），见 图 。与 比 较，的 和蛋白表达增强，但其表达增强能被 抑制（），见图。对 细胞存活的促进作用与 比较，细胞增殖活力明显降低、凋亡增加，而 细胞活力较 明显升高、凋亡减少（）。与 比较，细胞增殖活力降低、凋亡增加（），见图。下游靶标情况使用 、在 线预 测网 站 搜 索 的上游靶 并取交集（图）。与 的特异性结合位点见图。对交集 进行 注释分析，发现 富集在 信号通路（）、信号通路（）两个通路中，与 信号通路以往均被证实与 密切相关 （图）。双荧光素酶报告实验结果显示，能显著降低 的荧光素酶活性（），见图。结果显示，在 患者血浆与 模型中均表达降低（）见图、。与 比较，的 和蛋白表达被抑制（），见图。在 轴的作用与 比较，细胞增殖活力被抑制，凋亡增加，加入 后细胞增殖活力提高，凋亡减少（）。与 比较，细胞增殖活力减少，凋亡增加（）。与 比较，细胞增殖活力提高，凋亡减少（）。见图。图 数据集 差异表达基因：不同患者血浆中 相对表达量；：不同细胞 的相对表达量；：不同细胞 的蛋白表达情况；：实验统计结果。：，与 比较；：，与 比较；：，与 比较。图 对 模型中 表达水平的影响重庆医学 年月第 卷第期：不同细胞增殖活力；：不同细胞流式细胞术检测结果；：不同细胞凋亡率统计。：，与 比较；：，与 比较；?：，与 比较；?：，与 比较。图 对 细胞存活的促进作用：、网站预测结果；：与 的特异性结合位点；：的通路分析结果；：双荧光素酶报告检测结果；：检测 在患者血浆中的表达；：检测 在 模型中的表达；：的 相对表达量；：的蛋白表达情况；：实验统计结果。：，与 和 共转染比较；：，与 比较；?：，与 比较。图 下游靶标情况重庆医学 年月第 卷第期：不同细胞增殖活力；：不同细胞流式细胞术检测结果；：不同细胞凋亡率统计。：，与 比较；：，与 比较；?：，与 比较；：，与 比较；：，与 比较。图 在 轴的作用讨论 广泛存在于各种植物中，如金丝桃科、桔梗科、杜鹃花科、藤黄科等。已有研究证明，可显著减轻诱导的急性肾损伤、肾小管细胞凋亡和氧化应激。此外也有研究证实，通过激活多巴胺能神经元 信号，抑制羟基多巴胺诱导的氧化应激。本研究通过构建脑 体外细胞模型，证实了 能够减少 处理的 细胞凋亡，促进细胞增殖活力。这与之前 改善脑缺血损伤的研究结果一致。进一步对 在脑中发挥作用的潜在机制进行探究。本研究借助 数据库中 相关芯片，筛选了在 中差异表达的基因并将 纳入研究。等 在研究中发现，在模型小鼠中表达增强。本研究进一步通过临床检测和细胞实验证实了 在脑患者与 细胞模型中的表达升高。此外，实验发现 诱导的细胞内高表达 被 抑制。继续干预 的 表 达 并 设 计 功 能 实 验，结 果 显 示，与 比较，细胞活力被抑制，凋亡增加，而 在改善细胞凋亡、促进细胞活力方面效果明显。但转染 后 对 细胞的保护作用被抑制，提示 对脑的改善作用可能是通过抑制 的表达来实现。本研究证实了 与 存在靶向结合关系，实验证实 了 在脑患者与 模型中表达下调，可能在脑 发展中发挥重要作用。以往研究 显 示，敲 除 可 通 过 调 节 轴减轻大鼠脑 损伤。另外，能够 通 过 靶 向 减 轻 脑 损 伤。等 发现，上调 表达能够促进毛蕊异黄酮对脑缺血再灌注大鼠的保护作用。本研究发现，与 组比较，加入 能够抑制 细胞凋亡，但是 的 作 用 被 部 分 抵 消。敲 减 也能部分逆转 对 的作用，提示 对 细胞模型的影响可能是通过调控 实现的。本研究也存在一定不足之处。例如，仅从临床检测及体外 细胞实验的角度对 中 的差异表达进行了验证，未进一步从体内动物实验的角度对 作用网络的影响及 在中的作用进行探究。此外，未进一步探究 可能调控的信号通路，这也是作者之后要重点关注的方向。综上所述，本研究证实 通过调控 轴影响 处理的 细胞增殖和凋亡，进一步明确了 在中发挥保护作用的分子机制，为的治疗提供了潜在的新靶点。参考文献 ，重庆医学 年月第 卷第期（）：刘春红，吴诗卉，武文文，等 人参皂苷 抑制脑缺血再灌注细胞坏死的实验研究 重庆医学，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，：，（）：，：（收稿日期：修回日期：）重庆医学 年月第 卷第期