解冻方式对鸡腿肉蛋白氧化特性的影响_梁诗惠.pdf

研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)223DOI:10 13995/j cnki 11 1802/ts 030331引用格式:梁诗惠，冯钰敏，邓华荣，等 解冻方式对鸡腿肉蛋白氧化特性的影响 J 食品与发酵工业，2023，49(5):223 229LIANG Shihui，FENG Yumin，DENG Huarong，et al Effects of thawing methods on protein oxidation characteristics of chick-en thigh meat J Food and Fermentation Industries，2023，49(5):223 229解冻方式对鸡腿肉蛋白氧化特性的影响梁诗惠1，冯钰敏1，邓华荣2，刘巧瑜1，白卫东1，吴俊师1，陈海光1*1(仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室，农业农村部岭南特色食品绿色加工与智能制造重点实验室，现代农业工程创新研究院，广东 广州，510225)2(深圳市金谷园实业发展有限公司，广东 深圳，518000)摘要从蛋白质的氧化、聚集程度、蛋白质结构以及组织学特性方面，探究不同解冻方式(室温解冻、流水解冻、冷藏解冻和微波解冻)对冷冻鸡腿肉肌原纤维蛋白理化性质的影响。结果表明，室温解冻的羰基含量最高，为3 63 nmol/mg，巯基含量和 Ca2+-ATPase 活性最低，分别为110 55 mol/g 和0 72 U/mg，说明室温解冻组的蛋白氧化最为严重;肌球蛋白轻链条带模糊，有轻微降解现象;拉曼光谱结果中-转角含量(26%)和无规则卷曲含量(31%)相对较高，蛋白质结构的稳定性较差。流水解冻的蛋白氧化程度较轻，具体表现为:其羰基含量和表面疏水性最低，分别为 0 97 nmol/mg 和 10 36 g;Ca2+-ATPase 活性最高，为 2 95 U/mg;组织结构紧密，-螺旋含量最高(58%)，蛋白质二级结构较为完整。冷藏解冻的巯基损失最小，巯基含量为 258 23 mol/g，肌球蛋白轻链条带颜色较深，有聚集现象，组织结构的紧密性与流水解冻组无明显差异。微波解冻的组织结构破坏严重，肌纤维间隙较大，蛋白质二级结构较紊乱，-螺旋含量最少，为 29%。因此，流水解冻可以作为解冻鸡腿肉的主要解冻方式。关键词解冻方式;鸡腿肉;肌原纤维蛋白;蛋白氧化;蛋白质结构第一作者:硕士研究生(陈海光教授为通信作者，E-mail:chg1508163 com)基金项目:广东省重点领域研发计划项目(2019B020212002);2021 年广东省现代农业产业技术体系创新团队项目(2021KJ117)收稿日期:2021-12-10，改回日期:2022-01-22冷冻肉不仅作为国家调节肉类食品市场的重要产品，也是肉制品在国内运输及进出口贸易的主要形态1。但是肉品在冷冻解冻过程中会引起蛋白质和脂质氧化，最终影响食用品质。肌原纤维蛋白氧化是指肉类肌肉中的主要结构蛋白及功能性蛋白发生了由活性氧、活性氮直接诱导的，或氧化生成的次级产物间接诱导的一些共价修饰。这些共价修饰会使蛋白质发生一些不可逆改变，如蛋白变性、结构损伤等，最终影响食品的食用品质2。近年来，关于解冻方式对肉类蛋白质氧化的研究很多。王琳琳等3 主要研究 5 种不同解冻方式对牦牛肉蛋白氧化功能特性及新鲜度的影响，研究发现牦牛肉经空气解冻后，其肌原纤维蛋白氧化程度最大，具体表现为羰基含量、表面疏水性指数最高，巯基含量和 Ca2+-ATPase 活性最低。蔡璐昀等4 研究不同超声辅助解冻对海鲈鱼肌原纤维蛋白理化性质的影响，发现超声微波解冻方式对海鲈鱼蛋白质的降解程度影响较小，该方式可以更好地维持海鲈鱼蛋白质结构。刘磊等5 用不同解冻方式(低温解冻、流水解冻和微波解冻)对鹅腿肉进行解冻，以拉曼光谱的测定结果表征蛋白质二级结构的变化，发现低温解冻对蛋白质二级结构的影响较小，流水解冻的影响较大。本文以冷冻鸡腿肉为研究对象，在前期研究基础上，探究室温解冻、流水解冻、冷藏解冻、微波解冻 4种解冻方式对蛋白质氧化程度、蛋白质聚集或降解情况、蛋白质结构以及组织学特性方面进行研究，探讨不同解冻方式对冷冻鸡腿肉肌原纤维蛋白的影响，以明确不同解冻方式对鸡肉品质影响的可能机制。1材料与方法1 1材料与仪器冷冻鸡腿肉(厚度为 1 cm 的鸡腿块)，深圳市金谷园实业发展有限公司;三氯乙酸、无水乙醇(均为分析纯)，天津市百世化工有限公司;2，4-二硝基苯肼、盐酸胍(均为分析纯)，南京圣比奥生物科技公司;三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl 缓冲液)，上海麦克林生化科技有限公司;超微量 Ca2+-ATPase 试剂盒，南京建成生物工程研究所;双缩脲试剂盒，上海食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES2242023 Vol.49 No.5(Total 473)源叶生物科技有限公司。JY600C 电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司;T6000 酶标分析仪，深圳雷社生命科学股份有限公司;XploA PLUS 共聚焦拉曼光谱仪，堀场(中国)贸易有限公司。1 2试验方法1 2 1解冻方式(1)室温解冻(A)。将冷冻鸡腿肉样品(20 0.5)的室温下解冻，用数字温度计测得鸡腿肉中心温度为 0 即可。(2)流水解冻(B)。将冷冻鸡腿肉样品置于流水下进行解冻，保持流速恒定。用数字温度计测得鸡腿肉中心温度为 0 即可。(3)冷藏解冻(C)。将冷冻鸡腿肉样品放入冰箱中进行4 冷藏解冻，用数字温度计测得鸡腿肉中心温度为 0 即可。(4)微波解冻(D)。将冷冻鸡腿肉样品用保鲜袋装好后放入微波炉中进行解冻，用数字温度计测得鸡腿肉中心温度为 0 即可。1 2 2肌原纤维蛋白(myofibrillar protein，MP)的提取参考 LIU 等6 的方法并稍作修改，从鸡腿肉中分离提取 MP。将鸡腿肉和预冷的 Tris-HCl 缓冲液(0 1 mol/L KCl 溶液和 20 mmol/L Tris-HCl 溶液，pH 7.0)按料液比 1 4(g mL)用高速匀浆机以10 000 r/min 的速度匀浆 3 次。用 20 目筛网过滤后离心(5 000 r/min，4，离心15 min)。上清液倒出，将颗粒收集为粗 MP。重复上述步骤 4 次，获得高质量的 MP。整个过程均在 4 下进行。1 2 3羰基含量的测定测定羰基的方法按照 LEVINE 等7 方法进行修改，方法如下:准确称取质量 0 1 g 鸡肉糜加入0 9 mL 的匀浆介质进行匀浆后离心(2 500 r/min，10 min)，使用双缩脲法测定上清液的蛋白浓度。同时取045 mL 蛋白溶液与005 mL 的缓冲溶液混匀后离心(11 000 r/min，10 min)。取 0 1 mL 上清液，加入0 4 mL 2，4-二硝基苯肼的盐酸溶液(空白样品反应液中不含 2，4-二硝基苯肼)，37 下避光反应30 min，加入0 5 mL 质量分数20%的三氯乙酸，振荡后离心(12 000 r/min，10 min)。将蛋白沉淀用 1 mL的 V(乙醇)V(乙酸乙酯)=11溶液洗涤4 次，加1 mL盐酸胍溶液(6 mol/L)，在 37 下水浴 15 min 溶解沉淀，离心(12 000 r/min，15 min)。取上清液于 370 nm处测定吸光值，使用摩尔吸光系数计算。1 2 4巯基含量的测定参考 BEVEIDGE 等8 的 Ellman 试剂分析方法并稍加改动测定 MP 总巯基，将提取好的 MP 用20 mmol/L pH 6 的磷酸盐缓冲液稀释至质量浓度为5 mg/mL 的 MP 溶液。吸取 10 L 肌原纤维蛋白溶液和 150 L Ellman 试剂到酶标板孔中，剧烈振荡使其反应完全，以不加 2-硝基苯甲酸 5，5-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB 组为对照，在 405 nm 处测定吸光值，计算蛋白总巯基含量。1 2 5表面疏水性的测定参照 CHELH 等9 的方法稍作修改，取 5 mL MP溶液(5 mg/mL)与 1 mL 溴酚蓝溶液(1 mg/mL)混合均匀后 2 000 r/min 离心 15 min。以无 MP 的磷酸盐缓冲液为空白对照，上清液稀释 10 倍后在 595 nm 处测定吸光度。以溴酚蓝结合量来计算，如公式(1)所示:溴酚蓝结合量/g=(A对 A样)200A对(1)1 2 6Ca2+-ATPase 活性的测定Ca2+-ATPase 活性按试剂盒说明进行测定。1 2 7SDS-PAGE 分析将提取好的 MP 用缓冲液稀释至质量浓度为40 mg/mL 的 MP 溶液。采用 MAINO 等10 的方法进行试验，使用 4%浓缩胶和 12%分离胶来分析解冻后样品的蛋白质变化。1 2 8组织学特性参考 JIANG 等11 的方法并进行修改:将样品切成小块后用 4%多聚甲醛浸泡 24 h，再用 70%95%乙醇溶液梯度脱水1 h，经二甲苯透明处理后再包埋、染色。用 CaseViewer 软件进行分析。使用 10 的物镜倍数，截取片段，以及随机选取 5 个点测量其肌纤维间隙，每点共测量 10 组肌纤维直径的数据。1 2 9肌原纤维蛋白二级结构测定参考袁丽等12 的方法稍作修改，将 MP 均匀涂抹在载玻片上，采用激发波长 532 nm，曝光时间 8 s，循环 15 次，衰减程度 25%，波数为 400 2 000 cm1测定参数随机选取的 3 个位置进行测定。1 3数据处理与分析所有试验重复 3 次，结果以平均值 标准偏差表示。用 IBM SPSS Statistics 19 软件进行显著性分析，用 Origin 2018 制图。研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)2252结果与分析2 1不同解冻方式对鸡腿肉羰基含量的影响羰基是肽键断裂和氨基酸侧链被自由基氧化生成的主要产物之一，是判断肌原纤维蛋白氧化程度的重要指标之一13。蛋白氧化会使包裹在蛋白质分子内部的氨基酸暴露，使羰基化合物的生成量增多14。由图 1 可知，室温解冻鸡腿肉中羰基含量最高(3 63 nmol/mg)，微波解冻次之(3 24 nmol/mg)，二者之间差异并不显著(P 0 05)。这与侯晓荣等15 的研究结果相似，其研究发现中国对虾在微波解冻时因温度较高从而导致羰基化合物的生成量偏大。冷藏解冻的羰基含量较低(2 04 nmol/mg)，也可能是因为低温抑制了蛋白酶活性。流水解冻方式下的羰基含量最低(p 0 05)，为 0 97 nmol/mg，说明流水解冻方式下生成的羰基化合物较少，氧化程度较轻。图 1不同解冻方式对鸡腿肉羰基含量的影响Fig 1Effect of different thawing methods on thecarbonyl content of chicken thigh meat注:不同小写字母代表显著性差异(P 005)下同2 2不同解冻方式对鸡腿肉巯基含量的影响研究表明，冷冻解冻过程中，巯基容易发生氧化生成二硫键以及生成相应的共价化合物，从而导致巯基含量降低16。由图 2 可知，冷藏解冻的巯基含量(285 23 mol/g)显著高于其他 3 种解冻方式(P 0 05)，说明低温解冻方式对鸡腿肉的总巯基损失影响较小，这与崔燕等17 提出的低温高湿解冻可以有效降低鲳鱼巯基的氧化速度的研究结果一致。流水解冻的疏基含量次之，为 188 31 mol/g，氧化程度相对较低。室温解冻的巯基含量最低(110 55 mol/g)，可能原因是解冻温度较高且解冻时间较长，导致该组样品的肌球蛋白头部结构发生变化，巯基间的相互作用导致蛋白质的聚集作用更加强烈18。就巯基含量这一指标而言，冷藏解冻方式优于其他 3 种解冻方式。图 2不同解冻方式对鸡腿肉巯基含量的影响Fig 2Effect of different thawing methods on