绞股蓝中总皂苷含量测定方法_许芳瑞.pdf

食品工业 2023 年第44卷第 4 期 138 研究探讨绞股蓝中总皂苷含量测定方法许芳瑞1，刘新艳1，刘茜1,2，杨宇1，赵浩安1，曹炜1*1.西北大学食品科学与工程学院（西安 710069）；2.西安西大生命科学与健康研究院有限公司（西安 710069）摘要建立比色法测定绞股蓝中总皂苷含量的方法。采用75%乙醇热回流提取绞股蓝中总皂苷,通过D101大孔吸附树脂纯化提取液,采用香草醛-高氯酸法比色体系测定绞股蓝中的总皂苷含量。结果表明,人参皂苷Rb1在550 nm处有最大吸收,在0.040.25 mg有良好的线性范围,相关系数r2=0.999 2,平均加样回收率为102.65%,相对标准偏差(SRSD)为2.77%(n=6)。采用D-101大孔吸附树脂提取纯化绞股蓝皂苷的方法简单、准确、灵敏度高、重复性好,可用于绞股蓝中总皂苷含量的测定。关键词绞股蓝总皂苷;比色法;含量测定;人参皂苷Rb1Determination of Gypenosides in Gynostemma pentaphyllumXU Fangrui1,LIU Xinyan1,LIU Qian1,2,YANG Yu1,ZHAO Haoan1,CAO Wei1*1.College of Food Science and Technology,Northwest University(Xian 710069);2.Xian Xida Life Science and Health Research Institute Co.,Ltd.(Xian 710069)Abstract Establish a colorimetric method for the determination of total saponins in Gynostemma pentaphyllum.The total saponins in Gynostemma pentaphyllum were extracted by 75%ethanol and purified by D101 macroporous adsorption resin.The content of total saponins in Gynostemma pentaphyllum was determined by vanillin perchloric acid colorimetry.The results showed that ginsenoside Rb1 had a maximum absorption at 550 nm,with a good linear range of 0.04-0.25 mg,the correlation coefficient R2 was 0.999 2,and the average sample recovery rate was 102.65%as well as the relative standard deviation(SRSD)was 2.77%(n=6).Extracting and purifying Gynostemma saponins by D-101 macroporous adsorption resin was simple and accurate,and had high sensitivity and good repeatability,which could be used for the determination of total saponins in Gynostemma pentaphyllum.Keywords gypenosides;colorimetry;content determination;ginsenoside Rb1绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino）是葫芦科绞股蓝属的多年生草质藤本植物，又名七叶胆、五叶参、小苦药等。从绞股蓝中分离的绞股蓝皂苷被认为是其药理活性和临床效应最重要的活性成分之一，因其具有和人参皂苷相同的四环三萜达玛烷型结构而备受关注，绞股蓝也是目前已知的非五加科人参属植物中唯一含有人参皂苷类成分的植物，其中皂苷XLIX和A是目前已知能够定量的绞股蓝皂苷。研究表明其具有降血脂1、抗癌2、抗氧化3、神经保护4等生物活性。随着绞股蓝的各项研究不断深入，开发利用逐渐广泛，绞股蓝中总皂苷的定量是绞股蓝开发利用的关键。不同产地、不同品种、不temperature pre-treatment and enzymatic hydrolysisJ.Preventive Nutrition and Food Science,2016,21(4):338-347.20 徐星.植物油氧化过程中脂肪酸和挥发性成分变化的研究D.杭州:浙江工商大学,2013.21 刘娜,徐盛春,张古文,等.不同菜用大豆品种籽粒挥发性组分鉴定及其差异J.浙江农业学报,2017,29(8):1321-1328.22 SMITH T J,FOEGEDING E A,DRAKE M A.Flavor and functional characteristics of whey protein isolates from different whey sourcesJ.Journal of Food Science,2016,81(4):C849-C857.23 施小迪,郭顺堂.豆乳风味物质的研究进展J.食品安全质量检测学报,2014,5(10):3079-3084.24 郭建超,刘建营,李品红,等.广东地区荷斯坦牛生牛乳中脂肪酸的影响因素分析J.中国奶牛,2022(5):19-22.25 张宇,王立娜,张宏达,等.母乳、牛乳及山羊乳脂肪酸组成的差异分析J.食品工业科技,2019,40(4):21-26.26 葛丽琴.婴幼儿辅助营养补充品中脂质氧化机制及控制研究D.南昌:南昌大学,2019.27 JACH M E,SEREFKO A,ZIAJA M,et al.Yeast protein as an easily accessible food sourceJ.Metabolites,2022,12(1):63.28 UEMURA H.Synthesis and production of unsaturated and polyunsaturated fatty acids in yeast:Current state and perspectivesJ.Applied Microbiology and Biotechnology,2012,95(1):1-12.139 研究探讨食品工业 2023 年第44卷第 4 期*通信作者；基金项目：大学生创新创业训练计划项目（项目编号：202210697040），陕西省重点研发计划-重点产业创新链（群）（项目编号：2023-ZDLNY-30）同采收期的绞股蓝中总皂苷的含量不同，有关绞股蓝的质量标准不够健全，绞股蓝中总皂苷含量测定方法也没有统一标准，使得绞股蓝的质量得不到保障，这严重影响绞股蓝及其产品的疗效。因此，试验对绞股蓝中总皂苷含量的测定方法进行研究，旨在提供一种简捷、准确、重复性好的绞股蓝总皂苷的含量测定方法，为绞股蓝开发利用的质量控制提供科学依据。1材料与仪器1.1试验材料与试剂绞股蓝药材（购自陕西省平利县）；XAD-2大孔树脂、D-101大孔树脂（美国Sigma）；无水乙醇、正丁醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸（均为国产分析纯）；人参皂苷Rb1（纯度98%，批号wkq18020808，四川成都维克奇生物有限公司）。1.2仪器与设备（表1）表1仪器与设备仪器设备型号生产厂家电子分析天平JM-B5002余姚市纪铭称重校验设备有限公司小型粉碎机XT-1000A永康市红太阳机电有限公司低速大容量多管离心机 LXJ-上海安亭科学仪器冷冻干燥机FD1C50北京博医康实验仪器有限公司超纯水制备仪UPT-1-10T 四川优普超纯科技有限公司L5s紫外分光光度计L5S北京赛多利斯科仪器有限公司紫外可见分光光度计722G上海仪电分析仪器有限公司1.3试验方法1.3.1对照品溶液的制备精密称定适量人参皂苷Rb1对照品，加甲醇溶解，制成2 mg/mL的对照品溶液备用。1.3.2供试品溶液的制备取绞股蓝药材烘干，粉碎，过0.250 mm孔径（60目）标准筛。精密称定1 g绞股蓝粉末，置于圆底烧瓶中，加入50 mL 75%乙醇在80 下回流提取2次，每次1 h。冷却后离心并合并提取液，将提取液采用旋转蒸发仪真空浓缩至干，残渣加水定容至100 mL容量瓶。取1 mL上清液，移入装有大孔吸附树脂的层析柱，用25 mL水洗柱，弃去洗脱液，用25 mL 70%乙醇洗脱，收集洗脱液转移至旋蒸瓶旋干，用5 mL甲醇溶解，过滤即得样品液。取1 mL转移至具塞试管，通过氮吹仪挥干，以此作显色用。1.3.3显色溶剂挥干后，加入0.4 mL香草醛冰醋酸溶液，转动试管使残渣都溶解，加1.6 mL高氯酸，在60 水浴10 min，取出冰浴冷却3 min，准确加入5 mL冰醋酸，摇匀后，在最大吸收波长处进行比色。1.3.4最大吸收波长的确定将显色后的对照品和样品溶液在紫外可见分光光度计在400800 nm波长范围内扫描，分别得到标准品与样品的可见光谱扫描图样，确定其最大吸收波长。1.3.5线性关系考察精密量取20，40，60，80，100和120 L人参皂苷Rb1标准溶液分别置于具塞试管中，在60 氮吹仪挥干，按1.3.3的方法进行测定。以吸光度（A）为纵坐标，人参皂苷Rb1含量（mg）为横坐标进行回归计算，建立回归方程。1.3.6精密度试验平行精密吸取6份0.1 mL人参皂苷Rb1对照品溶液置具塞试管中，于60 氮吹仪挥干，按1.3.3的方法进行测定吸光度，并计算含量。1.3.7稳定性试验取样品溶液分别于显色后10，20，30，40，50，60，70，80和90 min测定吸光度。1.3.8加样回收率试验采用加标回收率法，平行吸取6份绞股蓝总皂苷提取液，分别加入样品总皂苷含量的50%，100%和200%的对照品溶液，各2份，按1.3.2的方法制备，以及按1.3.3的方法测定吸光度，按式（1）计算加标回收率，即以实际测得的样品中皂苷含量的增加量除以加标量。加标回收率=100%（1）加标试样测定值-试样测定量加标量1.3.9重复性试验取5份供试样品，每份精密称定1 g，按1.3.2的方法制备，按1.3.3的方法进行显色测定，在同一条件下记录吸光度并计算样品中的总皂苷含量。1.3.10不同绞股蓝样品中总皂苷含量的测定取陕西省平利县不同批次的绞股蓝、绞股蓝茶，按1.3.2的方法提取纯化后，按1.3.3的方法比色，在550 nm波长处测定吸光度，根据所得到的标准曲线计算样品中绞股蓝总皂苷含量。2结果与分析2.1检测波长的确定图1人参皂苷Rb1对照品光谱图食品工业 2023 年第44卷第 4 期 140 研究探讨根据有紫外吸收的化合物在最大波长处测量组分的吸光系数最大，灵敏度最高，可以准确地反映被测化合物的特征，排除其他具有紫外吸收物质的干扰。因此，为确保试验结果的准确性，需要确定试验中绞股蓝总皂苷的最大吸收波长。人参皂苷Rb1对照品溶液的光谱图如图1所示。结果显示，在550 nm波长处有最大吸收，这与齐敏杰5的结果相一致。2.2标准曲线线性范围以吸光度（A）为纵坐标，人参皂苷Rb1的含量（mg）为横坐标作图。如图2所示，试验中测定绞股蓝总皂苷含量的回归方程为y=3.872 3x-0.014，R2=0.999 2，结果表明，绞股蓝总皂苷（以Rb1计）在0.040.25 mg范围内线性关系良好，设计合理。图2对照品人参皂苷Rb1标准曲线图2.3大孔吸附树脂的选择大孔吸附树脂是一种新型的非离子型高分子吸附剂，它能通过物理吸附选择性地吸附溶液中的有机物，实现分离纯化6。试验提取液分别通过D101大孔