金银花FT基因的克隆及在不同花器官中的表达分析_林沂.pdf

江西农业学报 2023，35（01）：5663ActaAgriculturaeJiangxiDOI:10.19386/ki.jxnyxb.2023.01.009金银花 FT 基因的克隆及在不同花器官中的表达分析林 沂1，亓希武2，宛 燕1，房海灵2，仇丽云3，梁呈元1,2*（1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.江苏省中国科学院 植物研究所，江苏 南京 210014；3.常州金坛冰蕊金银花专业合作社，江苏 常州 213200）摘 要:在药用植物金银花中克隆了开花整合基因LjFT(Genbank登录号：OP700454)，并对其开展了生物信息学分析和不同花器官中的表达分析。结果表明：金银花LjFT基因包含4个外显子和3个内含子，编码框长度为525 bp，编码174个氨基酸残基，其所编码的蛋白质与其他植物FT序列高度保守；基于SWISS-MODEL和Alphafold 2这2种方法进行的蛋白结构预测表明金银花LjFT与拟南芥FT在蛋白质三级结构上高度保守；启动子分析表明LjFT启动子序列中含有大量激素响应元件、光响应元件和胁迫响应元件；系统进化分析表明LjFT与绣球HmFT亲缘关系最近；表达分析表明LjFT主要在花蕾期高量表达，尤其是花萼和花瓣中，开花后表达水平迅速降低。关键词:金银花；FT基因；表达模式 中图分类号：Q943.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8581（2023）01-0056-08 Cloning of FT Gene in Lonicera japonica and Its Expression in Different Floral Organs LINYi1,QIXi-wu2,WANYan1,FANGHai-ling2,QIULi-yun3,LIANGCheng-yuan1,2*（1.NanjingUniversityOfChineseMedicine,Nanjing210023China;2.InstituteofBotany,JiangsuProvinceandChineseAcademyofSciences,Nanjing210014China;3.ChangzhouJintanBingruiHoneysuckleProfessionalCooperative,Changzhou213200,China）Abstract:Inthisstudy,weclonedthefloweringintegratorgeneLjFT(Genbank:OP700454)inthemedicinalplantLonicera japonicaandperformedbioinformaticanalysisandexpressionanalysis.TheresultsshowedthattheLjFTgenecontained4exonsand3introns,withacodingframelengthof525bp,encoding174aminoacidresidues,anditsencodedproteinwashighlyconservedwithotherplantFTsequences.ProteinstructurepredictionbasedonSWISS-MODELandAlphafold2showedthatLjFTwashighlyconservedwithArabidopsisFTintermsofproteintertiarystructure.PromoteranalysisshowedthattheLjFTpromotersequencecontainedalargenumberofhormoneresponsiveelements,lightresponsiveelementsandstressresponsiveelements.PhylogeneticanalysisshowedthatLjFT wasmostcloselyrelatedtoHmFT inHydrangea macrophylla.Furthermore,expressionanalysisindicatedthatLjFTwashighlyexpressedinthebudstage,especiallyinthecalyxesandpetals,anddecreasedrapidlyafterflowering.Key words:Lonicera japonica;FTgene;Expressionpattern金银花(Lonicera japonicaThunb.)属忍冬科半常绿藤本植物，以其干燥花蕾或带初开的花入药1。作为传统中药材，金银花用药历史悠久，最早见于魏晋南北朝的药物典籍 名医别录2，具有清热解毒、疏散风热等功效，可用于治疗痈肿疔疮、风热感冒等病症3。现代药理学研究表明，金银花具有抗炎抗菌4、抗病毒5、抗氧化6、保护脏器7、抗血小板凝集、抗癌8以及增强免疫力等多种药理学活性9。近年来，金银花被广泛用于治疗多种严重的传染性疾病，在国家卫健委公布的 新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第九版）中，推荐用于治疗新型冠状病毒（COVID-19）的中成药金花清感颗粒和连花清瘟胶囊中都含有金银花成分10。根据植物形态的改变，金银花花期主要包括6个时收稿日期：2022-10-07基金项目：江苏省林业科技创新与推广项目“金银花林下间种模式研究与示范”(LYKJ202120)；常州市科技支撑计划项目“植物生长调节剂调控金银花花期的技术研究与示范”(CE20202006)。作者简介：林沂（1998），女，浙江温岭人，硕士研究生，主要从事药用植物资源研究。*通信作者：梁呈元。1 期林沂等：金银花FT基因的克隆及在不同花器官中的表达分析57期：幼蕾期、三青期、二白期、大白期、银花期和金花期。李晓娅等11研究表明，金银花最佳采收期为花蕾时期，尤其是二白期至大白期。开花是植物由营养生长到生殖生长的重要转变阶段，受到多种途径的调控。Blmel等12研究表明，拟南芥开花受到光周期途径、自主途径、春化途径、温度途径、赤霉素途径和年龄途径的调控。各个途径上的信号汇总整合到开花整合基因，再传递到分生组织，最后影响成花 13。对拟南芥和水稻等植物进行研究发现，FLOWERING LOCUS T(FT)基因是长距离发挥作用的“成花素”，在光感受器和生物钟结合启动了调控叶片维管组织的信号之后，其编码的FT蛋白作为一个长距离的信号传递到茎尖分生组织，从而诱导开花14-15。在拟南芥中，AtFT基因促进生殖和成花的转变16；蓝莓的VcFT基因能够通过逆转光周期和低温胁迫促进早开花和连续开花17。此外，FT同源基因也独立地进化出开花抑制因子，比如大豆的GmFT4基因负向调控大豆开花18。可见，FT基因作为一种关键的开花整合基因，在成花转变的过程中发挥着重要作用19。本研究在金银花中克隆了开花整合基因FT并对其基因结构、序列特征、蛋白质结构、启动子顺式作用元件、系统发生等进行分析，此外，分析了其在不同发育时期的不同花器官中的表达模式，对揭示金银花开花分子机制具有重要意义。1 材料与方法1.1 主要试剂与设备主要试剂：PhantaMaxSuper-FidelityDNAPol-ymerase试剂，5minTA/Blunt-ZeroCloningKit试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；TSINGKETSC-C01Trelief5ChemicallyCompetentCell（北京擎科生物科技有限公司）；2Hieff PCRMasterMix(WithDye)翌圣生物科技（上海）股份有限公司；FlaPurePlantTotalRNAExtractionKit植物总RNA提取试剂盒，UnionScriptFirst-strandcDNASynthesisMixforqPCR(withdsDNase)，GSAntiQqPCRSYBRGreenMasterMix（北京金沙生物科技有限公司）。主要仪器：JY300C通用电泳仪电源；JY04S-3E凝胶成像分析系统（北京君意东方电泳设备有限公司）；Velocity18RPro高速冷冻离心机(Dynamica)；D3024台式高速微量离心机（赛洛捷克）；NanoOne超微量分光光度计（杭州佑宁仪器有限公司）；QuantStudio6Flex荧光定量PCR系统(ABI)。1.2 金银花总RNA的提取与cDNA的合成试验中用到的金银花来源于江苏省中国科学院植物研究所种质资源圃。在金银花幼蕾、三青、二白、大白、银花、金花等花发育的6个时期分别采集全花、花萼、花瓣、雄蕊及雌蕊等组织材料，使用液氮快速冷冻，置于-80冰箱中保存。使用FlaPurePlantTotalRNAExtractionKit对 金 银花各组织材料进行总RNA的提取，提取后对RNA的质量和浓度进行测定。根据浓度计算RNA反转所需的用量，使用UnionScriptFirst-strandcDNASynthesisMixforqPCR(withdsDNase)进行反转合成cDNA，并置于-20下保存。1.3 金银花FT基因的鉴定及基因克隆以拟南芥FT基因(AT1G65480)作为问询序列，在金银花全基因组序列(https:/ L）为：2 LcDNA，2 L上游/下游引物，25L2PhantaMaxBuffer，1LDNAPolymer-ase，1LdNTPMix，17LddH2O；反应程序为：95预变性3min；95变性15s，55退火15s，72延伸40s，35个循环；72延伸10min。PCR扩增完成之后利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行片段回收，再利用5minTA/Blunt-ZeroCloningKit试剂盒构建质粒，转化大肠杆菌DH5获取单菌落，随后筛选阳性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。1.4 生物信息学分析利用TBtools将金银花FT编码序列与基因组序列进行比对，分析其内含子和外显子，并利用在线 工 具Exon-IntronGraphicMaker(http:/wormweb.org/exonintron)绘制基因结构图；使用SMART在线工具(https:/smart.embl.de/)进行结构域预测；应用 在 线 工 具Protparamtool(https:/web.expasy.org/protparam/)和ProtScale(https:/web.expasy.org/protscale/)进行FT蛋白的基本生物信息学分析，包江 西 农 业 学 报35 卷58括相对分子质量、等电点预测以及氨基酸组成等；利用MetPhos-3.1在线工具(https:/services.healtht-ech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)分析磷酸化结构的可能位点；使用NetSurfP3.0在线工具(https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetSurfP-3.0)预测蛋白二级结构；应用在线工具SWISSMODEL(https:/swissmodel.expasy.org/)和 Alphafold2(https:/ FT基因启动子克隆及顺式作用元件分析使用CTAB法提取金银花基因组DNA。以金银花基因组中FT基因上游序列为参考，利用Primer5.0软件设计引物扩增FT启动子序列，上游引物为：5-TGTGCATTAGAATAACCCAT-3；下 游 引物 为：5-TGCCACCAATATCAACCC-3。以 金 银花基因组DNA为模板，扩增FT启动子序列并克隆，方法同1.3。启动子序列经测序验证之后，利用PlantCARE网站(https:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/pla