金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药性及耐药基因检测分析_李伦.pdf

安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Jul，27（7）金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药性及耐药基因检测分析李伦1，张丽娜1，王兵1，刘彩林2作者单位：1平顶山市第一人民医院检验科，河南 平顶山467000；2郑州大学第一附属医院检验科，河南 郑州450052基金项目：国家自然科学基金资助项目（82102438）摘要：目的 探讨金黄色葡萄球菌（SA）对万古霉素的耐药性及耐药基因分布情况。方法 收集平顶山市第一人民医院2020年4月至2022年3月临床送检样本分离的288株SA菌株，采用Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定和药敏系统以及纸片扩散法进行菌落鉴定与药敏试验；采用聚合酶链反应检测pbp4、mgrA、agr、vraS、vraR、icaA、icaR基因表达。结果 288株SA菌株中筛选出25株万古霉素异质性耐药金黄色葡萄球菌（hVISA）菌株，hVISA阳性率为8.68%，未检测到万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌（VISA）菌株和万古霉素耐药金黄色葡萄球菌（VRSA）菌株；万古霉素敏感金黄色葡萄球菌（VSSA）菌株万古霉素最小抑菌浓度（MIC）主要分布在0.50 mg/L和0.75 mg/L，占比为41.83%和28.90%；hVISA菌株万古霉素MIC主要分布在1.50 mg/L和2.00 mg/L，占比为56.00%和28.00%；VSSA菌株pbp4、agr、icaR的相对表达量均低于hVISA菌株（P0.05），而mgrA、vraS、vraR、icaA的相对表达量均高于hVISA菌株（P0.05）。结论 本次调查hVISA两年总流行率为8.68%。与VSSA菌株比较，hVISA菌株pbp4、agr、icaR、mgrA、vraS、vraR、icaA基因表达存在差异，可能与万古霉素的耐药性有关。关键词：金黄色葡萄球菌；万古霉素；耐药；基因检测Resistance of Staphylococcus aureus to vancomycin and detection of resistance genesLI Lun1,ZHANG Lina1,WANG Bing1,LIU Cailin2Author Affiliations:1Department of Laboratory,Pingdingshan First Peoples Hospital,Pingdingshan,Henan 467000,China;2Department of Laboratory,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052,ChinaAbstract：Objective To investigate the drug resistance of Staphylococcus aureus(SA)to vancomycin and the distribution of drug resistance genes.Methods A total of 288 strains of SA isolated from clinical samples submitted in Pingdingshan First Peoples Hospital from April 2020 to March 2022 were collected.Vitek 2 Compact automatic bacterial identification,Drug Sensitivity System and disk diffusion method were used for colony identification and drug sensitivity test.The gene expressions of pbp4,mgrA,agr,vraS,vraR,icaA and icaR were detected by polymerase chain reaction.Results Among 288 SA strains,25 vancomycin heterogeneous resistant staphylococcus aureus(hVISA)strains were screened,and the positive rate of hVISA was 8.68%.Vancomycin mediated resistance staphylococcus aureus(VISA)strains and vancomycin resistant staphylococcus aureus(VRSA)strains were not detected.Vancomycin minimum inhibitory concentration(MIC)of vancomycin sensitive staphylococcus aureus(VSSA)strains were mainly distributed at 0.50 mg/L and 0.75 mg/L,accounting for 41.83%and 28.90%.The vancomycin MIC of hVISA strains were mainly distributed at 1.50 mg/L and 2.00 mg/L,accounting for 56.00%and 28.00%.The relative expressions of pbp4,agr and icaR in VSSA strains were lower than those in hVISA strains(P0.05),while the relative expressions of mgrA,vraS,vraR and icaA were higher than those in hVISA strains(P0.05).Conclusion The prevalence of hVISA in SA in our hospital in recent two years is 8.68%.There are differences in the expressions of pbp4,mgrA,agr,vraS,vraR,icaA and icaR genes between VSSA and hVISA strains,which may be related to the drug resistance of vancomycin.Key words：Staphylococcus aureus;Vancomycin;Drug resistance;Gene detection金黄色葡萄球菌（SA）是临床常见的致病菌，随着1961年英国首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）至今，MRSA检出率急剧上升，已成为临床抗感染治疗的一大难题1。万古霉素是治疗MRSA感染最常用的药物和最后防线2，然而随着MRSA感染率上升和万古霉素的大量广泛使用，万古霉素敏感性降低的MRSA及万古霉素治疗失败不断被报道3。尽管按照美国临床实验室标准化研究协会的判读折点，MRSA对万古霉素仍处于敏感范围，但国内外均有大量研究报道万古霉素异质性耐药金黄色葡萄球菌（hVISA）和万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌（VISA），且近年来其检出率呈上升趋临床医学引用本文：李伦，张丽娜，王兵，等.金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药性及耐药基因检测分析 J.安徽医药，2023，27（7）：1338-1342.DOI：10.3969/j.issn.1009-6469.2023.07.013.1338安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Jul，27（7）势，需引起临床高度重视4-5。目前关于SA对万古霉素的具体耐药机制尚不清楚，有研究发现菌种会通过基因调控方式来获得适应力6，也有研究发现hVISA 和 VISA 细胞壁相关代谢基因表达存在改变7。故本研究针对临床送检标本分离的SA进行万古霉素耐药性检测及基因检测分析，以期为临床合理治疗控制感染提供参考依据，详情如下。1材料与方法1.1菌株来源选取平顶山市第一人民医院2020年4月至2022年3月临床送检样本1 592例，分离出288株SA菌株（均为首次分离），检出率18.09%。SA样 本 来 源：脓 液 173 份（60.07%）、血 液 34 份（11.80%）、胸腹水 32 份（11.11%）、引流液 26 份（9.03%）、痰液23份（7.99%），去除重复菌株。1.2抗菌药物及培养基万古霉素抗菌药物、E-test实验条、血平板均购自郑州安图生物工程股份有限公司，脑心浸液琼脂基础和MH琼脂基础由英国Oxoid公司提供，脱纤维羊血购自郑州农达生物制品有限公司。1.3SA鉴定及抗菌药物敏感性检测试验 SA菌株经MH琼脂培养后挑选单个菌落，经革兰染色和触酶试验证实后用传统划线法接种于琼脂培养基上进行分离纯化，用法国生物梅里埃公司 Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定和药敏仪器及纸片扩散法进行菌株鉴定与药物敏感性试验，SA 质控菌株为ATCC29213和ATCC25923。采用E-test法检测万古霉素最小抑菌浓度（MIC），按照美国临床实验室标准化委员会（2021年CLSI M100-S31）推荐的方法进行操作，按CLSI规定的临界值对药物敏感性试验结果进行判读。1.4hVISA 的检测方法用 0.85%氯化钠溶液将SA菌株制备成浊度为0.5麦氏的菌悬液，经胰蛋白胨大豆肉汤过夜培养后用无菌L棒将原液、110-3稀释悬液、110-6稀释悬液涂于万古霉素浓度为 0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、2.5 mg/L、4.0 mg/L、8.0 mg/L的脑心浸液琼脂平板上，35 培养48 h，选取生长最好菌落的平板进行计数，并计算实际菌落数，实际菌落数=菌落计数相应稀释倍数。将Mu3作为阳性对照，采用Graphpad Prism8.0软件绘制菌落数对数值对万古霉素浓度的曲线，并计算曲线下面积，并与Mu3比较，结果判读：比值0.9判定为万古霉素敏感金黄色葡萄球菌（VSSA），比值0.9且1.3判定为hVISA，比值1.3判读为VISA8。1.5基因检测将SA菌株接种在血平板上，采用德国 QIAGEN 公司生产的 Puregene Yeast/Bact 试剂盒提取 RNA，采用 QuantiTect Reverse Transcriptase试剂盒进行逆转录合成cDNA，严格按照试剂盒说明书进行操作；采用实时定量聚合酶链反应检测pbp4、mgrA、agr、vraS、vraR、icaA、icaR 基因的表达，以16S RNA作为内参，以2Ct表示目的基因相对表达量，其中引物序列见表1。1.6统计学方法采用SPSS 23.0统计学工具处理数据，计量资料行正态性检验和方差齐性检验，均符合正态分布且方差齐，以x s形式描述，不同菌株耐药基因相对表达量比较采用独立样本t检验；计数资料以频数、百分比形式描述，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1MRSA检测结果及其对常用抗菌药物敏感性检测结果288 株 SA 筛选出 MRSA 菌株 116 株（40.28%），甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）菌株 172株（59.72%）。MRSA菌株和 MSSA菌株对利奈唑胺、替加环素、万古霉素均敏感，见表2。2.2hVISA 检测结果288 株 SA 共筛选出 25 株hVISA菌株，hVISA阳性率为8.68%，其余263株SA均对万古霉素敏感，未检测到VISA菌株和万古霉素耐药金黄色葡萄球菌（VRSA）菌株