解钾JX-10菌的筛选及解钾工艺_薛永萍.pdf

解钾 JX-10 菌的筛选及解钾工艺薛永萍 1,2，肖春桥 3，张琰图 4，池汝安 1（1.武汉工程大学 兴发矿业学院，湖北武汉430073；2.武汉工程大学邮电与信息工程学院，湖北武汉430073；3.武汉工程大学 环境与生物工程学院，湖北武汉430073；4.延安大学 化学与化工学院，陕西延安716000）摘要：本文从一钾长石矿区土壤中分离、筛选得到了 6 株高效解钾细菌。其中命名为 JX-10 的菌株分离于矿区茼蒿根系土壤，经基因测序鉴定为 Bacillus sp.，与 KT981886 菌相似度高到 99.72%。同时就培养时间、温度及转速等解钾工艺条件进行了探讨。实验结果表明，JX-10 菌株具有分解钾长石矿物的能力。其较佳解钾工艺条件为：培养温度 28、时间 10 d，转速 160 r/min，培养基 pH 值为 5.0，钾长石浓度 2 g/L，粒度 0.03mm，接种量 25%，硫酸铵浓度 0.2 g/L。在较佳工艺条件下，溶液中可溶性钾离子含量可达 23.32 mg/L，浸出率为 8.36%。关键词：解钾菌；筛选；鉴定；工艺优化doi:10.3969/j.issn.1000-6532.2023.02.004中图分类号:TD981 文献标志码:A 文章编号:1000-6532（2023）02001707 氮磷钾对农作物的生长起着极其重要的作用，但我国土壤中可溶性钾含量却严重贫乏1。我国又是人口大国，对钾肥需求量很大，据统计每年需进口 60%左右的钾肥2。为缓解我国钾肥紧缺，需从富含难溶性钾的硅酸盐矿物中分解有效钾3。虽已有研究报道，可采用物理法和化学法从钾长石矿物中提取难溶性钾，但随着大量化肥的使用，我国土壤结构已遭破坏，且人们赖以生存的环境也被污染，且食品安全也日益凸显4。鉴于此，我们需寻求一种新型微生物提钾技术，以实现低能耗，无污染和资源的循环利用。通过阅读大量文献，目前国内外报道最多的解钾菌主要有根瘤菌属（Sinorhizobium sp.）、固氮菌属（Azotobacter sp.）、芽胞杆菌属(Bacillussp.)等5。2017 年，姜霁航等从苹果树根系土壤分离得到 118 株解钾菌，其中 K1、K98、K115、K105 和 K168 具有较强解钾能力，平均可溶性钾含量为 41.47 mg/L。经鉴定 K1 为不动杆菌属（Acinetobacter sp.），K98、K115、K105 为假单孢菌属（Pseudomonas sp.），K168 为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)6。李春钢等从贵州福泉瓮福磷矿区采集大量土壤，并从中分离出了一株 FP.18 的解钾新菌株，经鉴定为肠杆菌属（Enterobacteriaceaebacteriium），能有效提高煤矸石中有效钾含量7。Bhattacharya 等于 2016 年从印度盐场分离得到一株土壤不动杆菌。该菌以廉价的葡萄糖、果糖为碳源，在 37，pH 值为 6.5，培养 120 h，发酵液中可溶性钾可达 68 mg/L8。由此可见，现有解钾菌主要从农作物根系或果树周围土壤筛选而得9。但以矿区土壤为来源分离解钾菌的报道较少，其原因主要在于矿区土壤贫瘠，所含微生物量少。微生物的生长和繁殖都有其赖以生存的环境，若能从矿区土壤中筛选得到解钾菌，则该菌会表现出较好的钾矿适应能力。通过对矿区农作物的调查，受矿区环境的影响，矿区农作物品种较少，主要以生命力强且环境适应性强的油菜、茼蒿等为主。由于茼蒿具有开胃消食、利肠通便、止咳化痰等多种功能，且 收稿日期:2021-02-01；修回日期:2021-05-06基金项目:国家自然科学基金（51674178）；国家重点研发计划（2018YFC1801800）。作者简介:薛永萍（1979-），女，博士，副教授，主要从事微生物冶金等研究。通信作者:池汝安（1959-），男，博士，教授，主要从事稀土矿物加工及分离等研究。第 2 期矿产综合利用2023 年 4 月Multipurpose Utilization of Mineral Resources 17 已得到众多科研工作者的高度重视。因此本文旨在从矿区茼蒿根系土壤中分离筛选解钾菌，并对其解钾工艺进行优化，以提高菌的解钾能力。并在今后的研究中有望利用该菌株制备生物有机肥，并应用于茼蒿盆栽实验。不仅避免因过度使用化肥而造成土壤板结、土壤污染等问题，也可提高茼蒿品质和产量，进一步提升茼蒿的药用型，食用性。1材料与方法 1.1材料、试剂及培养基 1.1.1材料和试剂土壤：采集湖北省随州市某钾长石矿区茼蒿根系土壤。钾长石：实验所用钾长石系矿区提供，经粉碎过筛，依次用去离子水、3 M 盐酸浸泡24 h、72 h，以去除矿粉中的可溶性离子。最后用去离子水清洗 3-5 次，至 pH 值=7，烘干保存备用10。1.1.2培养基基础培养基：葡萄糖 10 g，磷酸氢二钾 0.2 g，氯化钠 0.2 g，硫酸镁 0.2 g，硫酸亚铁 0.002 g，硫酸锰 0.2 g，氯化钙 0.2 g，硫酸铵 0.2 g，二次蒸馏水 1000 mL，pH 值 5.0。解钾培养基：葡萄糖 10 g，钾长石矿粉 2 g，氯化钠 0.2 g，硫酸镁 0.2 g，硫酸亚铁 0.002 g，硫酸锰 0.2 g，氯化钙 0.2 g，硫酸铵 0.2 g，二次蒸馏水 1000 mL，pH 值 5.0。1.2实验方法 1.2.1解钾菌的分离筛选富集培养：称取供试土壤 100 g，加 1000 mL无菌水，依次搅拌、纱滤。配置土壤悬浮液，吸取 5 mL 加到装有 50 mL 基础培养基的三角瓶，于 170 r/min、30 下培养 2 d；然后再从上一次的培养液中吸取 5 mL 发酵液，同等条件下培养。按相同方法，进行多次富集培养，直至溶液澄清。在此过程中需将 K2HPO4的用量依次减少，其目的是为了提高微生物在解钾培养基上的适应能力。菌种筛选：移液枪吸取 200 L 经多次富集后的澄清菌液，均匀涂布并于 30 恒温培养箱内倒置平板培养。观察菌落形态，进行菌落的反复分离纯化。将不同形态的单菌斜面培养，4 保藏。1.2.2解钾菌株形态及鉴定通过显微镜对已筛选得到的解钾菌株观测其形态，并进行生理生化特性实验分析。送至上海美吉生物有限公司进行基因测序鉴定。测序所使用引物为：27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。经 与NT 数据库比对，鉴定其种属。1.2.3解钾菌解钾能力测定量取 60 mL 解钾培养基分装于 250 mL 三角瓶中，根据实验设定方案，加入一定量的钾长石矿粉，121 灭菌 20 min。制备活化菌悬浮液，并按一定体积比接入摇瓶，在设定工艺条件下发酵培养。每组平行 3 次，且以不接种为对照组。发酵培养后移出发酵上清液于 9000 r/min 高速离心30 min，经 0.45 m 微孔膜过滤，采用原子吸收法测定溶液中有效钾离子含量。1.2.4优势菌解钾工艺优化采用单因素法，探讨培养时间、温度及转速等因素对解钾菌的生长和解钾能力的影响。2结果与分析 2.1解钾菌的分离筛选及鉴定通过大量实验，从矿区土样中筛选得到了6 株具有解钾功能的真菌，其中命名为 JX-10。JX-10 菌株为一色白中略带粉色的细菌，在显微镜下（放大 100 倍，油镜）可观测到较大的顶囊，菌丝粗有间隔，分生孢子成球形。通过基因测序鉴定 为 Bacillus sp.，与 KT981886 菌 相 似 度 高 到99.72%。利用 MEGA6 软件，绘制了该菌树状发育系统，见图 1。2.2JX-10 菌株分解钾矿机理为了阐明 JX-10 菌株分解钾矿机理，对经该菌株溶蚀的矿粉进行了红外检测，结果见图 2。从图 2 可知，在 2923、2854、1744、1647、1544 和 1038 cm-1出现了羧酸盐的特征吸收峰。由此可推测，该菌株在代谢过程中产生了有机酸。因此，可推测该菌株主要是通过代谢产生的有机酸，经矿粉表面的水化膜渗入矿粉内部使其微环境变化，使其晶格破坏致其崩解，通过化学降解释放了矿物中的钾离子。2.3JX-10 菌解钾工艺优化 2.3.1培养时间对溶液中可溶性钾离子含量的影响使用 1.2.4 工艺优化方法，固定培养温度、转 18 矿产综合利用2023 年速，培养基 pH 值，钾长石浓度及粒度，接种量，硫酸铵浓度，分别为 28、160 r/min，pH 值=5.0，2 g/L，0.03 mm，25%，0.2 g/L。在上述条件下发酵培养，测其在不同培养时间下溶液中可溶性钾离子含量，结果见图 3。0510152025305051015202530接种 JX-10 菌株后溶液中钾离子浓度未接种溶液中钾离子浓度0246接种 JX-10 菌株后发酵液 pH未接种发酵液 pH 024681012JX-10 菌株溶钾浸出率钾浸出率/%pH 值接种时间/天可溶性钾离子浓度/(mgL1)图 3 培养时间对溶液中可溶性钾离子含量的影响Fig.3 Effect of different culture time on the soluble potassiumcontent 分析图 3，可以明显看出溶液中可溶性钾离子含量随着培养时间的增加而增加，但当培养时间超过 10 d 时，钾离子浓度变化很小，可达 23.18mg/L，经计算得浸出率为 8.31%。由此可见，微生物分泌的有机酸量会随着碳源的减少而减少，进而降低了细菌的解钾能力11。2.3.2培养温度对溶液中可溶性钾离子含量的影响按照 1.2.4 工艺优化方法，将培养温度设定为20，24，28，32，36，40，其他工艺条件同2.2.1，在上述条件下发酵培养 10 d，测溶液中可溶性钾离子含量，见图 4。16202428323640441012141618202224接种 JX-10 菌株后溶液中钾离子浓度培养温度/钾浸出率/%可溶性钾离子浓度/(mgL1)24681012JX-10 菌株溶钾浸出率图 4 培养温度对溶液中可溶性钾离子含量的影响Fig.4 Effect of the cultivation temperature on the solublepotassium content 由图 4 可得，溶液中可溶性钾离子含量随着培养温度的增加先增加后减少。28 时其解钾能力最强，钾离子含量为 23.32 mg/L，浸出率高达8.32%。这一结果表明，微生物的生长和繁殖需要适宜的温度，在此温度下微生物分泌有机酸较多，使其分解矿物的能力也较大12。2.3.3培养转速对溶液中可溶性钾离子含量的影响同样，采用 1.2.4 工艺优化方法，分别设定培养时间、温度，培养基 pH 值，钾长石浓度及粒度，接种量，硫酸铵浓度为 10 d、28，pH 值=5.0，2 g/L，0.03 mm，25%，0.2 g/L。再次探索转速对菌株分解矿物的影响，结果见图 5。KU986698.1:1-1429 Bacillus sp.strain SZ110 16S ribosomal RNA gene partial sequence KC692166.1:13-1451 Bacillus megaterium strain ML258 16S ribosomal RNA gene partial sequence MK824620.1:14-1446 Bacterium strain BS1432 16S ribosomal RNA gene partial sequence KX350034.1:4-1452 Bacillus megaterium strain F4-2-27 16S ribosomal RNA gene partial sequence MG430210.1:1-1444 Bacillus megaterium strain CS3 16S ribosomal RNA gene partial sequence MK