基于转录组测序技术筛选NS...在卵巢癌细胞的基因差异表达_何婉珊.pdf

实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.9doi：10.3969/j.issn.10065725.2023.09.003基金项目：广州市科技计划项目（编号：202002030174）通信作者：罗喜平Email：基于转录组测序技术筛选NSUN2在卵巢癌细胞的基因差异表达何婉珊1，2洪小山2陈冠桥1陈斌1文斌2林育3韦之富4罗喜平1，21广州医科大学（广州 511436）；2广东省妇幼保健院妇科（广州 511400）；3南方医科大学（广州 510515）；4暨南大学附属顺德医院妇科（广东佛山 528000）【摘要】目的应用 RNAseq 技术研究 NSUN2 对卵巢癌细胞株 A2780 基因表达的影响，为阐明NSUN2在卵巢癌症发生发展中的作用提供理论依据。方法慢病毒介导的RNA干扰技术抑制A2780细胞中NSUN2的表达。以转染空载体的细胞为对照，使用RNAseq技术对干扰细胞株进行基因谱高通量测序分析，筛选出差异表达的基因。并通过KEGG Pathway、GO分析和GSEA富集分析，探索NSUN2调控的差异基因主要参与的相关信号通路和生物学过程。结果与对照组细胞相比，NSUN2敲低的A2780细胞株有1 642个差异表达的基因，其中上调基因有1 020个，下调基因有622个；通过GO分析、KEGG Pathway和GSEA富集分析发现差异表达基因主要富集在hedgehog信号通路、P53等信号通路上，参与了病毒转录、翻译起始和调节等生物过程；通过对P53信号通路的相关基因进一步分析，筛选出与改通路相关的3个关键基因（ZMAT3、EI24和CCND2），RTqPCR验证其表达结果与测序结果相符。结论A2780 shNSUN2组与A2780 shNC组的基因表达谱间存在明显的差异，其差异基因主要富集于P53信号通路。在卵巢癌中NSUN2可能通过调控P53信号通路相关因子的表达，从而调控了卵巢癌的发生发展。【关键词】NSUN2；卵巢癌；转录组测序技术；P53信号通路【中图分类号】R711.75Screening of gene differential expression of NSUN2 in ovarian cancer cells based on transcriptome sequencing technologyHE Wanshan*，HONG Xiaoshan，CHEN Guanqiao，CHEN Bin，WEN Bin，LIN Yu，WEI Zhifu，LUO Xiping.*Guangzhou Medical University，Guangzhou 511436，China；*Department of Gynecology,the Guangdong Women and Children Hospital,Guangzhou 511400,ChinaCorresponding author：LUO XipingEmail：【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of gene expression by NSUN2 in ovarian cancer cell lineA2780 by RNAseq technology，and to provide a theoretical basis for clarifying the role of NSUN2 in the occurrence and progression of ovarian cancer.MethodsExpression of NSUN2 in A2780 cells was knocked down bylentivirusmediated RNA interference technique.The cells transfected with empty vector were used as control，andthe interfering cell lines were screened for differentially expressed genes by highthroughput sequencing using RNAseq technology.KEGG Pathway，GO analysis and GSEA enrichment analysis were used to explore the related signaling pathways and biological processes of NSUN2regulated differential genes.ResultsCompared with the control cells，there were 1 642 differentially expressed genes in the A2780 cell line with NSUN2 knockdown，including 1 020 upregulated genes and 622 downregulated genes.Through GO analysis，KEGG Pathway and GSEA enrichment analysis，it was found that differentially expressed genes were mainly enriched in hedgehog signaling pathway and P53 signaling pathway，and were involved in viral transcription，translation initiation and regulation.Three key genes related to the P53 signaling pathway（ZMAT3，EI24 and CCND2）were screened out through further analysis of the genes related to the p53 signaling pathway.The expression results were verified by RTqPCRand the sequencing results were consistent.ConclusionThere are significant differences in gene expression profiles between A2780 shNSUN2 group and A2780 shNC group，and the differential genes are mainly concentratedin P53 signaling pathway.In ovarian cancer，NSUN2 may regulate the occurrence and development of ovarian cancer by regulating the expression of P53 signaling pathway related factors.【Key words】NSUN2；ovarian cancer；RNAseq technology；P53 signaling pathway基 础 研 究1079实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.9卵巢癌（ovarian cancer）作为全球女性第 8 位常见癌症和癌症死亡原因1，是妇科癌症中最常见的恶性肿瘤之一，由于其早期临床症状较为隐匿，一般被发现时绝大多数患者已发展到卵巢癌中晚期。目前针对卵巢癌的一线治疗方式主要是手术和以铂类为主的化疗，尽管在手术方式和药物治疗方案上的优化已经有所进展，但是卵巢癌的5年生存率仍然低于50%23，因此，不断深入对卵巢癌疾病发展机制的探索是很有必要。近年来，RNA表观遗传修饰已不断被证明与癌症的发生和进展密切相关45，其中属于 NOL1/NOP2/sun结构域家族的成员 NSUN2，是 m5C RNA 修饰的一种重要的甲基转移酶，其通过对多种RNA类型进行定向的甲基化修饰，参与了细胞的多种生物功能过程，如细胞增殖6、细胞分化7、细胞迁移8等。此外，NSUN2 对 mRNA 的稳定9、翻译和输出1011，tRNA的稳定12以及miRNA的成熟13等方面同样起着重要的作用。目前，大部分的研究数据发现NSUN2的异常表达和多种癌症的进展过程有着密切联系，如 NSUN2 在胃癌中通过抑制 p57Kip2的表达从而促进胃癌细胞增殖14。在食管鳞癌中，NSUN2 通过促进 GRB2 的 m5C 修饰15，使LIN28B 识 别 m5C 修 饰 的 GRB2 并 稳 定 GRB2mRNA，从而增加了 PI3K/AKT 和 ERK/MAPK 信号的激活，促进食管鳞状细胞癌进展。在鼻咽癌中，NSUN2的异常高表达水平促进了鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和转移16，并且 NSUN2 负向调节鼻咽癌肿瘤微环境中的免疫细胞浸润，暗示其可作为预测鼻咽癌患者预后不良的潜在生物学指标。在妇科癌症中，NSUN2也被发现在宫颈癌中异常高表达17，其通过促进了 KRT13 上的 m5C 修饰，而使m5C甲基化的KRT13 mRNA被YBX1 识别和稳定，从而增强了宫颈癌的侵袭和迁移功能。但NSUN2在卵巢癌中的调控机制目前尚未有研究，因此本研究通过构建 NSUN2 敲低的 A2780 细胞株，以转染空载的A2780细胞为对照，进行RNAseq和生物信息分析，从而筛选出NSUN2主要参与调控的关键基因和通路，进一步探索了NSUN2在卵巢癌发生和进展中的潜在分子机制，旨在为未来卵巢癌的治疗提供新的思路和方向。1材料与方法1.1主要试剂和抗体NSUN2 单克隆抗体（proteintech）、GAPDH 单克隆抗体（proteintech）、羊抗鼠 抗 体（invitrogen）、羊 抗 兔 IgG 抗 体（abcam）、0.25%TrypsinEDTA 胰蛋白酶消化液（新赛美），RPMI1640（life science）、胎牛血清（vistech）、蛋白marker（Thermo fisher scientific）、BCA 蛋白定量试剂 盒（Thermo fisher scientific）、RIPA Lysis Buffer（弗德生物）、5 SDSPAGE Sample buffer（GenStar）、超敏 ECL 显色液（弗德生物）、polybrene（爱必信）、Lipofectamine 2000 转染试剂（invitrogen）、Trizol（美国 Gibco 公司）、GOScriptTMReverse Transcription system（promega）、ChamQ Universal SYBRqPCR Master Mix（南京诺唯赞）。1.2设 备台 式 冷 冻 离 心 机（德 国 Eppendorf5427R）、PCR 仪（美国ABI ProFlexTMPCR system）、台式低速离心机（BY320A）、化学发光成像系统（BIOrad chemiDocTMimaging system）、实时荧光定量 PCR 仪（罗氏 LightCycler 480II）、细胞培养箱（Thermo scientific Forma SteriCycle i160）、倒置显微 镜（Olympic ckx53）、Hier 医 用 冷 藏 箱（HYC118）、Hier 医用低温保存箱（DW25L92）、Haier 超低温保存箱（DW86L728J）。1.3细胞培养人卵巢癌细胞系A2780由中山大