间充质干细胞在小型猪重组牙...种异体移植中的免疫调节作用_吴志芳.pdf

北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.112近年来，牙科领域里，牙再生组织工程取得了突破性进展，人类再生出具有类似于天然牙的美学和功能的第三副牙齿有望成为可能1,2。已有研究证明，将胚胎期小鼠牙胚细胞解离重组后，移植到成年小鼠牙槽骨内或肾囊膜内，可再生出与天然牙齿结构和功能相似的全牙3,4。相对于小鼠，小型猪不但在免疫和生理等方面与人类更接近；而且牙齿数量、大小、形态、牙型、发育周期、萌出、替换及发育机制等方面跟人类更为相似；因此，小型猪是目前研究牙齿发育和再生的理想模式动物5,6。然而，在小型猪体内实现同种异体组织或器官移植，需要克服免疫排斥等问题。间充质干细胞最初在骨髓中发现，具有低/无免疫原性和免疫调节功能7,8，可通过调节 T、B淋巴细胞等免疫细胞发挥免疫抑制功能9,10，是一种非常有效且相对安全的免疫抑制剂，已被用于自身免疫疾病的临床治疗和降低重要脏器移植的免疫排斥反应的研究和临床11,12。他克莫司（tacrolimus），又名 FK506，是一种强力的新型免疫抑制剂，是目前器官移植的常用免疫抑制剂之一。本实验研究骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）单独使用或与FK506 联合应用，对小型猪重组牙胚同种异体移植的免疫调节作用，为后续大型动物牙再生研究，探索一种可靠的、可克服同种异体种子细胞移植排斥的免疫干预方法。间充质干细胞在小型猪重组牙胚同种异体移植中的免疫调节作用吴志芳 徐亿普 王福 夏登胜【摘要】目的 探索在小型猪重组牙胚同种异体移植实现颌骨内牙再生过程中，间充质干细胞 BMMSCs 的免疫调节作用。方法 将胚胎小型猪帽状期牙胚解离重组后，移植至成年小型猪拔牙区，BMMSCs 经分离鉴定后，单独或与他克莫司 FK506 联合应用，进行同种异体移植免疫干预；评估受体小型猪的免疫状况和牙再生小型猪百分比。结果 BMMSC 组受体小型猪 CD3+细胞和 CD3+CD8+细胞比例均显著下降（P 0.05），Tregs 细胞比例显著上调（P 0.05），有牙再生的小型猪百分比为 75%；而 BMMSC+FK506 组 CD3+和 CD8+T 细胞比例均显著下调（P 0.05），但 Tregs 比例与空白对照组无显著差异，该组 25%小型猪有牙再生；空白对照组的免疫排斥相关指标上调，未发现牙再生。结论 相对于与 FK506 合用，单独使用 BMMSCs 更有利于同种异体重组牙胚移植。【关键词】间充质干细胞；同种异体移植；小型猪；重组牙胚；免疫调节【中图号】R739.8【文献标识码】A【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2023.01.003Immunomodulatory effects of mesenchymal stem cells on allogenic re-associated tooth germ transplantation in sus scrofa WU Zhi-fang,XU Yi-pu,WANG Fu,ZHOU Jian,XIA Deng-sheng.Department of Integrated Emergency Dental Care,Capital Medical University School of Stomatology,Beijing 100050,China【Abstract】Objective To explore whether MSCs can be applied to reduce immune rejection in allogenic tooth germ transplantation for tooth regeneration in Sus scrofa.Methods In the present study,the allogeneic re-associated tooth germs at cap stage were transplanted into the jawbones of host minipigs.After isolation and identification,allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells(BMMSCs)alone or with FK506 were administrated to reduce immune rejection.Immune condition of the host minipigs was evaluated and numbers of minipigs with successfully regenerative teeth were counted.Results Immunological assessment of host minipigs suggested that percentage of CD3+T or CD3+CD8+T cells significantly decreased,whereas that of CD25+FoxP3+Tregs exhibited a significant increase in the peripheral blood after administration of BMMSCs,and the percentage of minipigs with regenerative teeth was 75%in BMMSC group.Allogeneic re-associated tooth germs were all rejected in the negative control group,without tooth regeneration.Conclusions BMMSCs are more beneficial for allogenic re-associated tooth germ transplantation to regenerate tooth in Sus scrofa.【Key words】Mesenchymal stem cells;Allogenic transplantation;Sus scrofa;Re-associated tooth germ;Immunomodulatory effect 作者单位：100050 北京 首都医科大学口腔医学院急诊综合诊疗中心（吴志芳、徐亿普、夏登胜）；大连医科大学附属口腔医院综合科（王福）通信作者：夏登胜，E-mail:，电话：010-57099252北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.113材料和方法1.实验动物骨髓间充质干细胞来源于 1 头 18 月龄实验用小型猪。牙胚细胞供体为 9 头 50 天胚胎小型猪（E50），后者由 1 头妊娠 50 天实验用小型孕猪经术前 B 超验证后剖腹产获得。受体为 12 头 16 20月龄实验用小型猪。实验用小型猪均由中国农业大学动物研究所提供。所有动物实验经首都医科大学伦理委员会批准。2.试剂和主要设备-MEM、胎牛血清、成脂诱导培养基（Gibco，美国）；谷氨酰胺、维生素 C、青-链霉素、0.25%胰蛋白酶（Trypsin-EDTA 0.25%）（InvitroGen，美国）；I 型胶原酶、Dispase、阿司匹林（Sigma，美国）；胶原凝胶（Nitta gelatin，日本）；淋巴细胞分离液（Sigma-Aldrich，美国）；成骨诱导培养基（Cyagen，美国）；麻醉试剂（氯胺酮、速眠新）（聖鑫，中国）；流式抗体（BD Biosciences，加拿大）。常规妇产科手术器械、显微外科器械、便携式 B 超仪（CSBT/B-51，中国）；体式显微镜 DP71（OLYMPUS，日 本）；Transwell 三 维 培 养 装 置（Corning，美国）；种植机（NOUVAG AG，MD20，瑞士）；流式细胞仪（BD，美国）。3.研究方法骨髓间充质干细胞的获取：从小型猪股骨通过骨髓穿刺法获取骨髓，经淋巴细胞分离液密度梯度离心后，获取上数第二层目标细胞，进行细胞培养。培养基：-MEM、10%FBS、1%双抗、1%谷氨酰胺。置于 37，5%CO2和 95%空气条件的细胞培养箱内培养，每隔 3 天换液。7 天后使用 0.25%胰蛋白酶传代培养。骨髓间充质干细胞鉴定：表面标志物鉴定：流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志物 CD29、CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD31 和 CD45 的表达情况。成骨诱导及茜素红染色：第 3 代细胞以 2103个/cm2的浓度接种于6 孔板中，等细胞生长至 80%融合后，更换为成骨诱导培养液，对照组加入普通培养基，每 2 天换液，光镜下观察钙结节形成情况；诱导 23 周后，进行茜素红染色。成脂诱导及油红 O 染色：将第 3 代的骨髓间充质干细胞按 1104/孔接种于 12孔板中，用成脂诱导培养基培养，按说明书步骤进行换液。细胞在此种培养基诱导 34 周后，用油红O 染色法检测。牙胚的获取、分离重组及体外三维培养：获取E50 天胚胎小型猪后，置于无菌 PBS 内，齐下颌角水平剪下标本头部，沿口裂水平剪开，分离上下颌，在体式显微镜下用显微镊子分离上下颌第二乳切牙牙胚（E50 天时，该牙胚处于帽状期6）。在体视镜下,分离牙胚上皮和间充质；并分别用 Collagen I 3 mg/ml和 Dispase4 mg/ml 酶消化法，解离成上皮和间充质单细胞悬液：离心后分别成细胞团。将牙胚上皮细胞团（1105个细胞）置于含胶原凝胶的间充质细胞团（1105个细胞）上方，制成重组牙胚后，再经 Transwell 三维培养 7 天，用于移植2。同种异体牙胚移植：重组牙胚（后续简称牙胚）移植 3 月前，拔除受体小型猪的上颌尖牙和前磨牙；移植前拍 CT 确认无残余牙体组织2。移植时，受体猪麻醉完善后，仰卧位，术区常规消毒铺巾，切开上颌拔牙区黏膜，剥离黏骨膜，种植机制备种植孔，备孔全程用生理盐水冲洗冷却，将需要移植的牙胚分别置于一侧上颌骨种植孔内，用含阿司匹林（100 g/孔）的明胶海绵覆盖，每孔周围用一个钛钉进行标记，严密缝合。每头小型猪移植 3 个牙胚。实验动物分组及免疫干预：为了克服同种异体移植的免疫排斥，实验采用了 BMMSCs 和 FK506进行免疫干预，根据免疫干预措施，受体小型猪随机分为三组：BMMSC 组、BMMSC+FK506 组，空白对照组，每组 4 头。前两组于牙胚回植前 1 天从受体猪耳缘静脉给予(2.687.36)106/kg 的骨髓间充质干细胞13（图 1）。BMMSC+FK506 组受体小型猪除骨髓间充质干细胞免疫干预外，于牙胚回植前 1 天开始，根据药品说明书，每天还通过饲料饮食给予 1.33 mg/kg FK506，连续 2 周。空白对照组：仅接受牙胚移植，不采用任何免疫干预。免疫状况的检测：分别于免疫干预前 3 天、干预后第 3、7、21 天，从前腔静脉获取受体猪外周血，进行流式细胞检测，分析 CD3+细胞、CD8+T 淋巴细胞、CD25+Foxp3+T 淋巴细胞、CD79+活化 B 细胞等的比例，并检测血清中 IgM，IgG 和 IgA 等的浓度。评估牙再生小型猪百分比：移植 3 月后，取移植部位组织进行 HE 染色，检测牙再生情况，并计算各组出现牙再生小型猪占每组样本量的百分比。北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.1144.统计学分析应用 SPS