高效液相色谱法同时测定清肝益脾胶囊中靛蓝和靛玉红含量_徐明昊.pdf

2023 年 6 月 20 日 第 32 卷第 12 期Vol.32，No.12，June 20，2023China Pharmaceuticals红芪和黄芪中 4 种异黄酮类成分的含量对比 J.中国实验方剂学杂志，2018，24（9）：52-58.10孟祥才，沈莹，杜虹韦.道地药材概念及其使用规范的探讨 J.中草药，2019，50（24）：6135-6141.11何春萍，何庭，张莉，等.不同加工方法不同采收期对湖南灰毡毛忍冬药材质量的影响 J.中药材，2016，39（8）：1817-1819.12韩亚平，李安平，雷振宏，等.浅析药材质量的影响因素 J.农业开发与装备，2015，32（12）：88-89.13王宗权，贾继明，宋剑，等 不同产地黄芪中黄芪皂苷、黄芪皂苷和黄芪皂苷含量测定 J.药物分析杂志，2010，30（7）：1191-1194.14王亚丽，田曼，李江，等 HPLC-DAD-ELSD 法同时测定黄芪中 10 个成分的含量 J.中南药学，2018，16（9）：1268-1271.15马天成，孙宇，张金玲，等 UPLC-MS 同时测定黄芪中10 种化合物含量 J.中药材，2019，42（4）：838-844.16张黄琴，严辉，钱大玮，等 不同产地百合药材中 8 种活性成分的分析与评价 J.中国中药杂志，2017，42（2）：311-318.（收稿日期：2022-11-10；修回日期：2023-02-15）*基金项目：江苏省苏州市“科教兴卫”青年科技项目 KJXW2018044，KJXW2022048 ；江苏省苏州市科技发展计划项目 SKYXD2022099 。第一作者：徐明昊，男，在读硕士研究生，研究方向为中药学，（电子信箱）。通信作者：程军平，男，博士，副主任药师，研究方向为临床药学，（电子信箱）。中图分类号：R917；R927文献标志码：A文章编号：1006-4931（2023）12-0088-03doi:10.3969/j.issn.1006-4931.2023.12.021高效液相色谱法同时测定清肝益脾胶囊中靛蓝和靛玉红含量*徐明昊1，王斯琦2，苏子衡1，潘韵芝2，程军平2（1.南京中医药大学附属苏州市中医医院，江苏 苏州215000；2.江苏省苏州市第五人民医院，江苏 苏州215000）摘要：目的建立同时测定清肝益脾胶囊中靛蓝和靛玉红含量的高效液相色谱法。方法色谱柱为 Hypersil ODS2 柱（250 mm 4.6 mm，5 m），流动相为甲醇-水（70 30，V/V），流速为 1.0 mL/min，检测波长为 290 nm，柱温为 30，进样量为 10 L。结果靛蓝和靛玉红质量浓度分别在 7.63122.00 g/mL、5.0080.00 g/mL 范围内与峰面积线性关系良好（R2 0.999 8）；精密度、稳定性、重复性试验结果的 RSD 均小于 3.0%；平均加样回收率分别为 96.93%和 98.40%，RSD 分别为 1.36%和 1.42%（n=6）。结论所建立的方法简便，结果准确，重复性好，可用于清肝益脾胶囊的质量控制。关键词：清肝益脾胶囊；靛蓝；靛玉红；高效液相色谱法；含量测定Simultaneous Determination of Indigo and Indirubin in Qinggan Yipi Capsules by HPLCXU Minghao1，WANG Siqi2，SU Ziheng1，PAN Yunzhi2，CHENG Junping2（1.Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing University of Chinese Medicine，Suzhou，Jiangsu，China215000；2.The Fifth PeoplesHospital of Suzhou，Suzhou，Jiangsu，China215000）AbstractAbstract：ObjectiveTo establish the high-performance liquid chromatography（HPLC）method for the simultaneous determinationof indigo and indirubin in Qinggan Yipi Capsules.MethodsThe chromatographic column was Hypersil ODS2 column（250 mm 4.6 mm，5 m），the mobile phase was methanol-water（70 30，V/V），the flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelengthwas 290 nm，the column temperature was 30，and the injection volume was 10 L.ResultsThe linear ranges of indigo andindirubin were 7.63-122.00 g/mL and 5.00-80.00 g/mL respectively（R2 0.999 8）.The RSDs of precision，stability andrepeatability tests were all lower than 3.0%.The average recovery rates of indigo and indirubin were 96.93%and 98.40%respectively，with RSDs of 1.36%and 1.42%respectively（n=6）.ConclusionThe established method is simple，accurate andrepeatable，which can be used for the quality control of Qinggan Yipi Capsules.Key wordsKey words：Qinggan Yipi Capsules；indigo；indirubin；HPLC；content determination清肝益脾胶囊系中医临床经验方，具有改善肝功能、降酶、退黄，增强细胞免疫功能，有疏肝健脾、清利湿热功效。该方以泥鳅为君药，清热疏肝、调节免疫，辅以臣药青黛抗炎保肝，最后佐以僵蚕提高机体免疫力，全方配伍得当，临床治疗慢性乙肝的疗效良好1-2。但现行质量标准中检测项仅有制剂通则要求的项目，不利于清肝益脾胶囊的质量控制。青黛药材中靛蓝和靛玉红为发挥抗肝损伤的主要有效成分。本研究中通过查阅文献 3-5，建立了同时测定清肝益脾胶囊中靛蓝和靛玉红含量的高效液相色谱（HPLC）法，以为该制剂的质量控制提供参考。现报道如下。1仪器与试药1.1仪器Agilent 1260型液相色谱仪（美国Agilent公司），包括检验检测Inspection and Test882023 年 6 月 20 日 第 32 卷第 12 期Vol.32，No.12，June 20，2023China Pharmaceuticals1.靛蓝2.靛玉红A.混合对照品溶液B.供试品溶液C.阴性对照品溶液图1高效液相色谱图1.Indigo2.IndirubinA.Mixed reference solutionB.Test solutionC.Negative reference solutionFig.1HPLC chromatogramsABC1501209060300-30t/min0246810 12 14 16 18 20 22 24U/mV3020100-10-20-30t/min0246810 12 14 16 18 20 22 24U/mV360300240180120600t/min0246810 12 14 16 18 20 22 24U/mV1212四元泵，全自动进样器，检测器，蒸发光散射检测器，工作站；XO-5200DTD型超声波清洗机（南京先欧仪器制造有限公司）；1-14K型高速离心机（美国Sigma-Aldrich公司）；PL203型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。1.2试药清肝益脾胶囊（苏州市第五人民医院自制，批号分别为 20200808，20201019，20210228）；靛蓝对照品（批号为 J1726025，含量 98%），靛玉红对照品（批号为20121805，含量 98%），均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（色谱纯，江苏强盛功能化学股份有限公司，批号为20210401）；N，N-二甲基甲酰胺（色谱纯，生工生物工程上海股份有限公司，批号为G506BA1009）；其余试剂均为分析纯，水为超纯水。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱：Hypersil ODS2柱（250 mm 4.6 mm，5 m）；流动相：甲醇-水（70 30，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：290 nm；柱温：30；进样量：10 L。2.2溶液制备分别取靛蓝、靛玉红对照品13.20，11.40 mg，精密称定，分别置100 mL容量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺适量，超声（功率250 W、频率40 kHz，下同）使溶解，再加N，N-二甲基甲酰胺定容，摇匀，即得单一对照品贮备液；各取适量，加N，N-二甲基甲酰胺制成混合对照品溶液。取样品内容物粉末约0.1 g，精密称定，置100 mL磨口锥形瓶中，精密加入N，N-二甲基甲酰胺10 mL，称定质量，在25 下超声提取30 min，放冷，再次称定质量，用N，N-二甲基甲酰胺补足减失的质量，经0.45 m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得质量浓度为10.00 mg/mL的供试品溶液。按清肝益脾胶囊处方及工艺制备不含青黛药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液6-9。2.3方法学考察系统适用性试验及专属性试验：精密量取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱中，与对照品溶液色谱有相同色谱峰，各色谱峰基线分离良好，且阴性对照无干扰。详见图1。线性关系考察：取靛蓝、靛玉红对照品各适量，精密称定，分别加入N，N-二甲基甲酰胺溶液制成质量浓度分别为7.63，15.25，30.50，61.00，122.00 g/mL和 5.00，10.00，20.00，40.00，80.00 g/mL 的系列对照品溶液。各取10 L，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以待测成分质量浓度（X，g/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，靛蓝为Y1=40.493X1+76.128（R2=0.999 8，n=5），靛玉红为Y2=34.631X2-9.045 8（R2=1.000 0，n=5）。结果表明，靛蓝和靛玉红质量浓度分别在7.63122.00g/mL和5.0080.00 g/mL范围内与峰面积线性关系良好10。精密度试验：取2.2项下同一批（批号为20201019）供试品溶液适量，按 2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果靛蓝、靛玉红峰面积的RSD分别为0.20%和2.13%（n=6），表明方法精密度良好。稳定性试验：取同一批（批号为20201019）供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，6，8，10，12，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果靛蓝和靛玉红峰面积的RSD分别为0.46%和2.31%（n=8），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。重复性试验：取样品（批号为20201019）内容物适量，共6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积，并计算含量。结果靛蓝、靛玉红含量的RSD分别为0.26%和2.10%（n=6），表明方法重复性良好。加样回收试