酱香型大曲中产4-乙基愈创...杆菌的筛选、鉴定及特性研究_王成俊.pdf

DOI：10.13746/j.njkj.2022171基金项目：五粮液集团公司产学研合作项目（CXY2020ZR002）；四川省科技厅重点研发项目（No.2021YFS0341）；酿酒生物技术及应用四川省重点实验室项目（NJ2017-01）；四川理工学院人才引进项目（2017RCL25）。作者简介：王成俊（1992-），男，硕士研究生，助理工程师，主要从事食品分析检测及白酒安全风险防控。通讯作者：袁思棋（1984-），男，讲师，博士（后），主要从事酿造微生物资源利用与开发，E-mail：；刘君，教授，博士（后），主要从事白酒风味物质与微生物代谢途径研究，E-mail：。酱香型大曲中产4-乙基愈创木酚芽孢杆菌的筛选、鉴定及特性研究王成俊1，2，李玲珊1，3，范梅1，3，刘君1，2，3*，袁思棋1，3*（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川 宜宾 644000；2.四川宜宾五粮液股份有限公司，四川 宜宾 644000；3.酿酒生物技术与应用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000）摘要：从酱香型大曲中筛选得到4株产4-乙基愈创木酚（4-EG）的菌株。通过形态学观察、生理生化试验和分子鉴定种属确定产4-EG量较高的一株菌为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus wsp-2-2，产4-EG量达到245.3 g/L。通过耐受性实验研究，结果表明所确定菌株wsp-2-2能够耐受4%vol酒精度、15%的糖度和pH5.5的酸碱度，为后续研究蜡样芽孢杆菌的4-EG生物合成及应用提供了理论基础。关键词：4-乙基愈创木酚（4-EG）；酱香白酒大曲；蜡样芽孢杆菌；菌株鉴定；耐受性分析中图分类号：TS262.3；TS261.1文献标识码：A文章编号：1001-9286（2023）04-0045-08Screening,Identification and Characterization of 4-EthylguaiacolProducing Bacillus Strains from Jiangxiang DaquWANG Chengjun1,2,LI Lingshan1,3,FAN Mei1,3,LIU Jun1,2,3*and YUAN Siqi1,3*(1.School of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Yibin,Sichuan 644000;2.Wuliangye Co.Ltd.,Yibin,Sichuan 644000;3.Sichuan Provincial Key Laboratory ofLiquor-making Biotechnology and Application,Yibin,Sichuan 644000,China)Abstract:Four strains that produce 4-ethylguaiacol(4-EG)were screened out from Jiangxiang Daqu.Morphological observation,physiological biochemical tests and molecular identification were used to identify the strains.The strain with high yield of 4-EG wasidentified as Bacillus cereus,and its yield of 4-EG reached 245.3 g/L.Tolerance experiments showed that the strain was resistant to4%vol alcohol,15%sugar and pH 5.5.This study has provided a theoretical basis for subsequent research on the biosynthesis andapplication of 4-EG in Bacillus cereus.Key words:4-ethylguaiacol(4-EG);Jiangxiang Daqu;Bacillus cereus;strain identification;tolerance analysis4-乙基愈创木酚(4-Ethylguaiacol，简称 4-EG；CAS No.2785-89-9)，化学名为 4-乙基-2-甲氧基苯酚，呈木香、烟味、香辛料和甜香兰素风味，具有缓和咸味等作用1。4-EG是酱香型白酒重要的微量香气成分，茅台酒中含 0.025 mg/L 的 4-EG 时，赋予茅台悠香醇厚风味，凸显其酱香风味2。此物质因具有酱香特征成为酱油的重要香气物质，酱油中蛋氨酰与4-EG的含量分别为3.99 mg/L与0.3 mg/L时，能让酱油呈现最佳风味3，在一定程度上减轻酱油的咸味，使味道呈现圆滑的效果4，还具有增香、防腐、杀菌等作用1，5。4-EG具有良好的活性氧消除功能，在抗氧化和预防心血管等多种疾病方面有一定作用6-8，是白酒中重要的风味物质和健康因子之一9-10，被广泛应用于酒类、酱油、饮料、食酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)4545酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)品、烟草等行业1，3-5，11。目前，生产4-EG的方法有直接提取法12、人工合成法13-14、生物转化法15-16。生物转化法生产4-EG是目前应用较为广泛的方法，具有反应条件温和，生产周期短，价格低廉，环境友好和生产成本低等优点15-17，已引起各国研究者的高度关注。本研究拟从酱香型大曲中分离具有产4-EG能力的芽孢杆菌类微生物作为目的菌株并探索其耐受条件，旨在为后续研究 4-EG 的生物合成及应用提供理论基础。1材料与方法1.1材料、试剂及仪器1.1.1样品酱香型大曲：来自于某酒业有限公司制曲车间。1.1.2试剂4-乙 基 愈 创 木 酚（C9H12O2，色 谱 级，CASNo.2785-89-9）标准品，购于上海源叶科技生物有限公司。其他试剂和药品均购于国内相关公司。1.1.3仪器设备气相色谱-质谱联用仪：TSQ8000（安捷伦公司，美国）；PCR 仪：5020（Thermo Fisher 公司，美国）；可见光分光光度计：UV-1800型（翱艺仪器上海有限公司）等。1.1.4培养基富集培养基、分离培养基、发酵培养基、葡萄糖试验培基、蔗糖试验培养基、乳糖试验培养基、淀粉试验培养基、VP试验培养基等培养基（表1）。富集培养基用于目的菌株的分离培养，发酵培养基只添加麸皮作为发酵前体物质进行目的菌株的复筛，葡萄糖培养基用于生理生化试验，淀粉培养基用于检验菌株是否能分解淀粉，VP培养基用于生理生化鉴定。1.2试验方法1.2.1菌种分离及筛选1.2.1.1富集培养称取10 g大曲，粉碎后加入到50 mL富集培养基中，185 r/min 振荡培养 4 h，取 10 mL 于 80 水浴锅中处理30 min，静置，取1 mL上清液加入到装有 50 mL 的富集培养基中，37、180 r/min 培养过夜。1.2.1.2初筛过夜培养的菌悬液按10倍梯度稀释到10-7，分别取10-5、10-6、10-7的稀释液0.1 mL涂布于分离培养基，37 培养24 h，根据菌落形态大小、颜色等挑取菌落划线分离纯化，将纯化后的纯菌落接种到斜面培养基上，37 培养24 h。过滤发酵液，通过GC-MS检测4-EG相对含量，选择出产4-EG较高的菌株进行后续复筛。1.2.1.3复筛初筛分离得到的菌株经活化后，培养成种子菌悬液，按5%的接种量接入复筛培养基，于37、表1培养基培养基富集培养基分离培养基发酵培养基葡萄糖试验培养基蔗糖试验培养基乳糖试验培养基淀粉试验培养基VP试验培养基明胶试验培养基成分蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，水1000 mL，pH7.27.4，121 灭菌20 min蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，水1000 mL，琼脂1520 g，pH7.27.4，121 灭菌20 min麸皮5 g，水100 mL，121 灭菌20 min磷酸氢二钾1.0 g，氯化钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，酵母粉0.2 g，葡萄糖10.0 g，水1000 mL，溴甲酚紫水溶液15 mL，pH7.0，121 灭菌20 min磷酸氢二钾1.0 g，氯化钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，酵母粉0.2 g，蔗糖10.0 g，水1000 mL，溴甲酚紫水溶液15 mL，pH7.0，121 灭菌20 min磷酸氢二钾1.0 g，氯化钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，酵母粉0.2 g，乳糖10.0g，水1000 mL，溴甲酚紫水溶液15 mL，pH7.0，121 灭菌20 min蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，酵母浸粉5.0 g，可溶性淀粉2.0 g（0.2%的可溶性淀粉），水1000 mL，pH7.27.4,121 灭菌20 min葡萄糖5.0 g，蛋白胨5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，pH7.0，121 灭菌20 min蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，酵母浸粉5.0 g，明胶1015 g，pH7.0，121 灭菌20 min4646180 r/min培养6 d，同时设置空白组。过滤发酵液，通过GC-MS检测4-EG相对含量。1.2.2菌种鉴定1.2.2.1菌种的形态学鉴定复筛得到的目的菌株，将其菌悬液梯度稀释后，涂布于平板上，37 培养32 h，观察菌落形态，挑单个菌落进行革兰氏染色和芽孢染色，用光学显微镜观察个体形态。1.2.2.2分子系统学鉴定分子系统学鉴定：离心收集对数期的培养菌液，采用Bacterial DNA Kit 试剂盒提取总DNA，提取得到的总 DNA 采用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。以目标菌株的总DNA为模板，采用16S rDNA通用引物（27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3），进行PCR扩增。扩增后产物送至上海生物生工公司进行测序。测序获得的数据进行人工比对和校正，在NCBI数据库中BLAST进行比对和数据相似性分析，借助MEGA7.0软件18，将目的基因序列与相关序列用Clustal W算法进行序列比对，利用p-dis-tance计算19并构建N-J法系统发育树20。1.2.3菌株的生理生化实验菌株生理生化鉴定包括接触酶试验、厌氧生长试验（浇筑法）、柠檬酸盐试验、糖发酵试验、淀粉水解试验、V-P试验、明胶试验。以上实验的操作流程按照实验流程进行。1.2.4菌种耐受性分析1.2.4.1耐酒精能力测定分别制备初始酒精度为 0、4%vol、8%vol、10%vol和12%vol的LB液体培养基，将培养好的目的菌株按2%的接种量分别接到各培养基中，于37、185 r/min培养24 h，600 nm测其吸光度，每个样品平行测3次取其平均值。1.2.4.2耐酸性能力测定分别制备初始pH值为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的LB液体培养基，将培养好的目的菌株按2%的接种量分别接到各培养基中，于37、185 r/min培养24 h，600 nm测其吸光度，每个样品平行测3次取其平均值。1.2.4.3耐糖性能力测定分别制备初始葡萄糖质量分数为 0%、5%、10%、15%、20%、25%的LB液体培养基，将培养好的目的菌株按2%的接种量分别接到各培养基中，于37、185 r/min培养24 h，600 nm测其吸光度，每个样品平行测3次取其平均值。1.2.54-EG的GC-MS分析初筛发酵液前