低温缺氧_复氧后大鼠心肌成...肌H9c2细胞间通讯的影响_佟睿.pdf

实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.9低温缺氧/复氧后大鼠心肌成纤维细胞对心肌H9c2细胞间通讯的影响佟睿1，2高鸿3安丽3易菁3曹莹4蒙富雪5吴学艳1马艳燕11贵州医科大学麻醉学院（贵阳 550000）；2哈尔滨医科大学附属第六医院麻醉科（哈尔滨 150000）；3贵州医科大学附属医院麻醉科（贵阳 550000）；4贵州医科大学附属金阳医院麻醉科（贵阳 550000）；5贵州医科大学第三附属医院医学实验中心（贵州都匀 558000）【摘要】目的观察低温缺氧/复氧（hypothermia hypoxia/reoxygen，H/R）后大鼠心肌成纤维细胞（ratcardiac fibroblasts，RCFs）对心肌H9c2细胞间通讯的影响并探讨其可能机制。方法将RCFs细胞与H9c2细胞以2:1数量比Transwell共培养后随机分为6组。其中T+Ang组及H/RT+Ang组加入1.5 nmol/L Ang，T+ARB组及H/RT+ARB 组加入1 nmol/L 缬沙坦。T组、T+Ang组及T+ARB组进行正常培养，H/RT组、H/RT+Ang及H/RT+ARB组进行H/R处理。检测各组培养液中Ang含量；H9c2细胞Cx43、ERK1/2表达量及磷酸化及细胞间通讯情况。结果与T组相比，H/RT组及T+Ang组H9c2细胞ERK1/2、Cx43表达及磷酸化水平降低（P 0.05），细胞间通讯减弱（P 0.05）；T+ARB组H9c2细胞ERK1/2、Cx43表达及磷酸化水平增高（P 0.05），细胞间通讯增强（P 0.05）。与 H/RT 组相比，H/RT+Ang组 H9c2 细胞ERK1/2、Cx43 表达及磷酸化水平降低（P 0.05），细胞间通讯减弱（P 0.05）；H/RT+ARB 组 H9c2 细胞ERK1/2、Cx43表达及磷酸化水平增加（P 0.05），细胞间通讯增强（P 0.05）。结论H/R处理后，RCFs细胞分泌增多的Ang可能通过抑制H9c2细胞MAPK/ERK通路下调Cx43表达，导致H9c2细胞间通讯减弱。【关键词】低温缺氧/复氧；心肌成纤维细胞；H9c2细胞；缝隙连接蛋白43；细胞间通讯【中图分类号】R654.1Effect of rat cardiac fibroblasts on H9c2 cardiomyocytes intercellular communication after hypothermiahypoxia/reoxygenationTONG Rui*，GAO Hong，AN Li，YI Jing，CAO Ying，MENG Fuxue，WU Xueyan，MAYanyan.*School of Anesthesiology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；*Department of Anesthesiology，the Sixth Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Haerbin 150000，ChinaCorresponding author：GAO HongEmail：【Abstract】ObjectiveTo observe the effect on myocardial H9c2 cells gap junction intercellular communication（GJIC）by rat cardiac fibroblasts（RCFs）after hypothermia hypoxia/reoxygen（H/R）and to explore the possible mechanisms.MethodsAfter cocultured of RCFs cells with H9c2 cells in a 2:1 number ratio by Transwell，cells was randomly divided into 6 groups.The T+Ang group and H/RT+Ang group were added 1.5nM Ang，and the T+ARB group and H/RT+ARB group were added 1nM valsartan.The T group，T+Ang group and T+ARB group were cultured normally，and the H/RT group，H/RT+Ang and H/RT+ARB group were treated withH/R.The Ang concentration in the culture medium；the expression and phosphorylation of Cx43 and ERK1/2；and GJIC of H9c2 cells were detected.ResultsCompared with the T group，the expression and phosphorylationof ERK1/2 and Cx43 were decreased（P 0.05）and GJIC was diminished（P 0.05）in H9c2 cells in the H/RTand T+Ang II group;he expression and phosphorylation of ERK1/2 and Cx43 were increased（P 0.05）and GJICwas enhanced（P 0.05）in H9c2 cells in the T+ARB group.Compared with H/RT group，he expression andphosphorylation of ERK1/2 and Cx43 were decreased（P 0.05）and GJIC was diminished（P 0.05）in H9c2cells in H/RT+Ang II group;and the expression and phosphorylation of ERK1/2 and Cx43 were increased（P 0.05）and GJIC was diminished（P 0.05）in H9c2 cells in H/RT+ARB group.ConclusionAfter H/R，increased Ang secretion by RCFs may downregulate Cx43 expression by inhibiting the MAPK/ERK pathway inH9c2 cells，resulting in diminished GJIC between H9c2 cells.【Key words】hypothermia hypoxia/reoxygenation；cardiac fibroblasts；H9c2 cells；connexin 43；gap junction intercellular communication基 础 研 究doi：10.3969/j.issn.10065725.2023.09.004基金项目：贵州省卫生健康委科学技术基金项目（编号：gzwkj2021270，gzwkj2022131）通信作者：高鸿Email：1086实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.9再灌注心律失常是体外循环下行心脏手术后，心脏缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury，I/RI）的主要并发症，其中主要为室性心律失常。心脏再灌注心律失常与心肌细胞间通讯及电同步性相关13。缝隙连接蛋白 43（connexin 43，Cx43）是一种广泛存在于心肌细胞的缝隙连接蛋白，主要在心室肌中表达46。其通过细胞间物质传递而稳定电化学信号7，进而稳定心肌电生理89。健康成年人的心肌中，心肌成纤维细胞占总细胞数量的60%70%10，能够导致心脏生物电传导减慢或阻滞，启动局部折返，并迫使冲动进入缓慢而迂回的传导通路，形成折返环导致心律失常的发生11。本课题组的前期研究中发现，低温缺氧/复氧（hypothermic hypoxia/reoxygenation，H/R）后 RCFs 细胞的培养液能够使得正常心肌细胞（cardiac myocytes，CMs）的死亡率增加、Cx43 表达量下降12 13，进而导致缝隙连接通讯功能（Gapjunction intercellular communication，GJIC）减弱，从而影响心肌细胞间电同步，诱发心律失常，但具体通过何种物质与其作用机制都尚不明确。CAO等14及 SALAMEH 等15的研究表明，Cx43 的表达受到ERK1/2磷酸化的调控，这也被我们的前期研究所证实16。血管紧张素（Angiotensin，Ang）是一类具有极强的缩血管和刺激肾上腺皮质分泌醛固酮等作用的肽类物质。研究发现，Ang能够调控心肌细胞Cx43的表达，且该种作用能够被血管紧张素受体抑制剂（Angiotensin receptorblockers，ARB）所逆转14，17。众所周知，心肌组织中成纤维细胞能够分泌Ang10，18，而心肌细胞几乎无法分泌10。FAN等19证实，Ang能够通过抑制 MAPK/ERK 通路激活下调大鼠心肌 H9c2 细胞Cx43的表达。因此，本研究将大鼠心肌成纤维细胞（rat cardiac fibroblasts，RCFs）与大鼠心肌 H9c2细胞共培养后 H/R 处理，假设 H/R 能通过促进RCFs 细胞 Ang的分泌，影响心肌细胞 MAPK/ERK通路的激活，下调H9c2细胞Cx43表达及磷酸化，进而减弱细胞间通讯，以期为缺血/再灌注后心肌细胞通讯减弱及心律失常的发生提供理论依据。1资料与方法1.1细胞培养与传代RCFs 细胞购自上海弘顺生物科技有限公司，H9c2心肌细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，均为种属鉴定正确细胞。使用含有 10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）（BI，以色列）和 1%青霉素链霉素的高糖培养基（Dulbeccos modified eagle medium，DMEM）（赛维尔，中国）于37 5%CO2+95%空气条件下进行培养。每 48 h 进行 1 次换液，待细胞密度达到 90%后，用0.25%含EDTA的胰酶消化后传代。选取10代以内的细胞进行实验以保证细胞活力。1.2分组及处理将 1105个/孔的 H9c2 细胞接种于 Transwell 培养小室的下层，2105个/孔 RCFs细胞接种于 Transwell 培养小室的上层，充分混匀后静置培养待细胞贴壁。将共培养的细胞随机分为6组，每组12孔。分别命名为共培养组（T组）、H/R共培养组（H/RT组）、共培养+Ang组（T+Ang组）、H/R共培养+Ang组（H/RT+Ang组）、共培养+ARB 组（T+ARB 组）及 H/R 共培养+ARB 组（H/RT+ARB组）。将细胞换液：T组及H/R组换用新鲜DMEM完全培养基，T+Ang组及H/RT+Ang组换用含 1.5 nmol/L Ang（APOxBIO，美国）的新鲜DMEM完全培养基，T+ARB组及H/RT+ARB组换用含1 nmol/L缬沙坦（APOxBIO，美国）的新鲜DMEM完全培养基。细胞换液后T组、T+Ang组及 T+ARB 组在正常培养条件（37 5%CO2+95%空气）下培养 5 h，H/R 组、H/RT+Ang组及 H/RT+ARB组置于密闭缺氧装置中，以5 L/min的流速