鸡gga-miR-199a慢病毒表达系统的构建_董小琳.pdf

第 卷 第期家畜生态学报 年月 科学研究鸡 慢病毒表达系统的构建 收稿日期 修改日期：基金项目陕西省重点研发计划（）作者简介董小琳（），女，辽宁本溪人，在读硕士，研究方向：动物生物技术。：通讯作者魏泽辉（），男，辽宁朝阳人，副教授，博士生导师，研究方向：动物生物技术。：董小琳，任远明，薛剑楠，王方，魏泽辉（西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 ；陕西省镇坪县畜牧兽医中心，陕西 镇坪 ）摘要为建立一种稳定持续表达鸡 的系统，将从鸡 细胞扩增到的 前体序列克隆入 慢病毒载体质粒中用以包装慢病毒。同时构建了更换 质粒中鼠源 启动子更换为鸡源及人源 启动子的 慢病毒载体质粒；将其与慢病毒包装辅助质粒共转至 细胞中，收集浓缩病毒颗粒并侵染细胞并获得过表达 的单细胞克隆。提取单细胞克隆总 进行 的定量检测。结果表明，经慢病毒侵染后的细胞中鸡 表达量显著提高，且人源 启动子的转录效率最高，该研究成功建立了一种稳定持续表达鸡 的慢病毒系统，说明该系统有利于在鸡活体或原代细胞中开展 功能的研究。关键词鸡；慢病毒；过表达 中图分类号 文献标识码 文章编号 （）：（）在基因功能研究中起重要的作用，它是一类广泛存在于真核生物中的长度约 的非编码 。通过与被调控的 或 互补结合，从而对靶基因进行调控，在细胞分化、周期和凋亡的调控中具有重要功能，并影响胚胎发育等生理学过程。但有关鸡 的研究进展较为缓慢，主要原因是鸡的细胞系较少，且培养时对血清、温度的要求较高，相对于其他物种不易培养，开展鸡原代细胞的研究效率又较低。因此，建立一种能够转导外源 至鸡原代细胞或活体的病毒表达系统，对鸡 功能的研究具有重要意义。慢病毒是一种可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持续稳定表达目的序列的载体。等使用慢病毒载体介导 在胃癌细胞中稳定表达，发现可有效调控其靶基因 、，并抑制了胃癌细胞的生长，迁移和侵袭。是调控参与生长发育关键基因的 ，但目前鸡 （）功能研究的报道还较少。刘津证明鸡 可通过抑制 调节蛋鸡与肉鸡骨骼肌发育，而关于 在鸡胚胎发育中作用的研 究 尚 未 见 报 道。为 进 一 步 挖 掘 鸡 在鸡胚生长发育中的功能，建立易于转染活体和原代细胞的慢病毒表达载体具有重要意义。然而，在常用的慢病毒表达载体 骨架载体中用于启动 前体的 启动子为鼠源序列。虽然 有 研 究 发 现 来 自 不 同 物 种 的 启 动 子 对 表达效率的影响不大，但目前还没有针对不同物种 启动子对 表达效率影响的报道。为获得最佳的过表达效果，本研究将 原载体中的鼠源 启动子替换为包装慢病毒的载体细胞 （人源）和目标细胞鸡源 启动子，并在 细胞中比较了不同启动子的效率。材料与方法试验材料 感受态细胞、细胞、细胞、包装质粒 、包膜质粒 、载体质粒 由西北农林科技大学动物基因组编辑实验室留存。相关试剂购于 公司；限制性内切酶 、和 购于 公司；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶试剂盒购于 试剂公司；基 因 组提取试 剂盒购于 公司；转 染 试 剂 购 于 公司；细胞培养相关试剂购于 生物公司；、反转录试剂盒、定量试剂盒购于 大连宝生物公司。目的基因片段的获得根据 数据库和 数据库查找鸡 前 体 基 因 序 列（），使用软件 设计扩增前体 基因序列的引物，同时在两端添加限制性内切酶 和 的酶切位点及其 保 护 碱 基，引 物 序 列 正 向 引 物 为：；反 向 引 物为：（扩增目的片段为 ），该引物由北京擎科生物公司合成。收集 细胞，并提取基因组，用于扩增 基因。扩增体系为：，酶，上下游引物各，模板 ，用 补齐至。使用 程序进行扩增 基因。产物经琼脂糖凝胶电泳进行纯化分离，将目的大小 条带的胶块切下，按照琼脂糖凝胶回收试剂盒操作提取目的片段基因。载体构建使用 和 对 骨架载体和 基因 扩增产物进行 酶切反应（），骨架进行胶回收，片段进行溶液回收。将回收产物用 连接酶连接，连接过夜后进行转化。热激法将连接产物转化到感受态细胞中，涂布在氨苄抗性的 固体培养基上。培养 后挑取单克隆菌落，接种入 培养基中继续培养，后提取质粒后送至擎科公司进行测序鉴定。使用 软件将测序结果与 数据库中 序列比对，确认载体构建是否成功。不同物种 启动子的载体构建利用上述构建的 载体中 启动子两端的酶切位点，使用 和 内切酶进行双酶切，回收酶切 启动子后的骨架，将鸡源和人源两物种的 启动子连接至骨架两酶切位点之间。鸡源 启动子 扩增自分离提取的鸡胚基因组 ，人源 启动子 扩增自 质粒，扩增两个启动子所用的 引物详见表。载体构建过程与所述方法相同。获得载体表鸡源和人源 启动子 扩增引物 物种 引物名称 序列 序列号 鸡 人 回收测序后，使用 软件与 数据库中 、序列比对，确认载体构建是否成功。使用鸡源和人源两物种 启动子构建的慢病毒包装载体分别命名为 和 （下简称为 和 ）。慢病毒包装与侵染将 接种到 培养皿中，待细胞融合 到 时 进 行 转 染。根 据 说明书，将种 载体质粒：空质 粒、和 （以下简称为 、）以 及 包 装 质 粒 、包膜质粒 按比例、进行转染。转染 后更换包毒缓冲液，内含终浓度 的 。和 分别收集细胞 上 清 液 至 离 心 管 中。将 病 毒 液 在 高速离心，弃掉上清，使用 的 及 稀释液溶解病毒。按照每孔 个细胞融合度将 细胞接种至 孔培养板中，待细胞贴壁后在培养基中滴加入 和 病毒悬液，后观察细胞荧光表达情况。使用有限稀释法在 孔板中接种病毒侵染后细胞，使每孔中约有个细胞。培养后观察细胞荧光并挑选只有一个阳性细胞克隆的孔，将该孔细胞扩大培养。收集细胞并用 漂洗后保第期董小琳，等：鸡 慢病毒表达系统的构建存在，用于不同 启动子效率的分析。表达情况检测氯仿抽提法提取上述病毒侵染后单细胞克隆的总，利用茎环法设计特异性引物（表）反转录 的 ，通用引物反转录总。设计并合成 的定量 引物（表）。持家基因 作为内参基因，在 荧光定量 仪中采用 法 检 测 的 表 达 量。扩增 每 个 样 本 重 复 次，使 用 计 算 相对表达量（以 空白病毒侵染组为对照）。不同启动子下 的表达量差异使用 软件进行方差分析，并采用 多重比较方法分析各物种启动子组与空病毒组之间的差异。表 茎环法反转录引物及定量 引物 引物名称（）序列（）（）（）结果与分析慢病毒表达载体构建以 细胞基因组 为模板进行 扩增得到的 片段（图），与 骨架载体的连接产物转化至 大肠杆菌感受态细胞中，随机挑取菌落接种至 培养基中，提取质粒进行测序验证，结果如图 所示，载体中 序列与数据库中序列完全一致。从鸡胚基因组 中和 载体中扩增鸡和人源的 启动子，扩增产物电泳如图 所示。其中 的条带为鸡源 启动子 ，图 载体鉴定 片段扩增条带；载体测序结果 ；的条带为源 启动子。将这两条片段替换掉 中鼠源 启动子后，测序结果图 和图 所示。人源的 启动子序列与数据库中的序列完全一致，证明 载体（）构建成功。鸡源 启动子序列与数据库中序列存在个位点的突变，经对不同鸡胚基因组中该片段进行测序，发现均存在相同突变，说明这些突变可能属于部分群体的固有突变，因此该片段可作为鸡源 启动子使用，说 明 载 体（）构建成功。慢病毒包装与侵染将包装质粒 、包膜质粒 分别与种载体质粒转染 细胞 后使用倒置荧光显微镜观察绿色荧光的表达，结果如图所示（以 为例），观察到明显绿色荧光，说明包装病毒质粒成功转染至 细胞中并高效表达。将种慢病毒包装质粒转染 细胞 后离心收集上清液，收集病毒颗粒。将浓缩后病毒侵染 细胞，后观察 荧光表达情况，如图所示。种慢病毒侵染的细胞均观察到绿色荧光，表明病毒包装成功且具有侵染能力。表达检测由图可知，与 空病毒侵染组相比，个慢病毒侵染组 的相对表达量均极显著增加（），最低增加 倍，说明个物种的启动子均能有效启动 的表达，其中人源 启动子的 相对表达家畜生态学报第 卷图 、载体鉴定 、片段扩增条带；载体测序结果；载体测序结果 ；图 病毒包装质粒转染效果（）图种慢病毒侵染细胞荧光表达情况（）图各物种启动子慢病毒侵染细胞中 相对表达量 量最高，为基础表达的 倍。讨论 是一类具有调控基因表达、参与细胞增殖凋亡分化及代谢过程作用的非编码，因此获得 持续稳定表达系统对于基因功能的研究尤为重要。在 中，家族被证明与众多肿瘤基因具有相关性。鸡大部分胚胎发育阶段发生在鸡蛋孵化过程中，因其在母体以外孵育，是极有价值的研究发育生物学的模式生物。但鸡的细胞系目前还很少，且不易培养，因此 在鸡发育中的研究有不容忽视的局限性。本研究建立了可以持续稳定过表达鸡 的慢病毒表达系统，且证明可显著提高 的表达水平，为后续鸡 生长发育功能的研究提供有效工具。慢病毒载体是以 病毒为基础，毒性致病基因被剔除，可介导外源目的基因表达的安全性很高的工具。慢病毒具有感染分裂细胞和非分裂细胞的作用，对于多种细胞都有广泛趋向性。且可以将外源基因整合入基因组，使其稳定持续表达外源基因的可行性提高。周峰等通过包装携带 的慢病毒，在 细胞中提高 表达 倍。张秦通过慢病毒包装 ，使 在细胞系中过表达约 倍。本研究利用 、和 质粒成功包装出不同物种启动子过表达鸡 的慢病毒。在 细胞中验证了这几种慢病毒均可有效侵染细胞，并将 表达量显著提高约 倍以上，证明该系统为高效稳定过表达系统，为后续研究提供了基础工具。因此该系统也可运用于鸡胚胎生长发育调控研究，探索 对鸡胚胎生长发育功能的影响。本研究中获得 稳定持续的过表达，说明建立慢病毒系统是实现鸡 过表达的有效手段。不同物种来源的启动子在异种细胞和活体上的活性可能存在差异。本研究构建了第期董小琳，等：鸡 慢病毒表达系统的构建种不同物种来源 启动子的慢病毒包装载体，以保证鸡 的表达效率达到最高。结果发现在 细胞中，人源 启动子相对于其他各物种启动子 的表达效率最高，因此推测 启动子启动 表达可能存在物种差异，后续研究可继续探索鼠、鸡细胞中不同启动子效率的差异。结论本研究构建了过表达鸡 的慢病毒包装系统，在 细胞中实现鸡 的高效过表达（倍），为鸡 功能研究提供基础工具。参考文献：，：，（）：，（）：，（）：，（）：刘津 通过抑制 调节蛋鸡与肉鸡骨骼肌发育的机制研究南京：南京师范大学，（）：，（）：，：周峰，张庆，张海清，等 携带 重组慢病毒的包装及其上调 中 的表达 免疫学杂志，（）：张秦 对 基因的调控以及对卵巢癌细胞 增殖的影 响 石 家 庄：河 北 医 科 大 学，（）：，（.，；.，）：，：；家畜生态学报第 卷