黄樟高频愈伤组织诱导及植株再生_刘新亮.pdf

第 51 卷 第 3 期东北林业大学学报Vol51 No32023 年 3 月JOUNAL OF NOTHEAST FOESTY UNIVESITYMar 20231)江西省林业局樟树研究专项(20200304);江西省自然科学基金项目(20224BAB205030)。第一作者简介:刘新亮，男，1986 年 12 月生，江西省林业科学院，国家林业草原樟树工程技术研究中心，副研究员。E mail:13611574029 163com。通信作者:戴小英，江西省林业科学院，国家林业草原樟树工程技术研究中心，正高级工程师。Email:dxy3842678 sinacom。收稿日期:2022 年 2 月 28 日。责任编辑:李春雪。黄樟高频愈伤组织诱导及植株再生1)刘新亮戴小英张月婷章挺(江西省林业科学院，南昌，330032)摘要以黄樟嫩茎腋芽萌发的新枝为外植体，以 MS 培养基为基本培养基，研究不同植物生长调节物质对诱导愈伤组织、分化不定芽、壮苗培养和生根培养的影响。结果表明:诱导产生愈伤组织的最适培养基为“MS 培养基 1 L+6苄氨基嘌呤(6BA)10 mg+2，4二氯苯氧乙酸(2，4D)02 mg”，诱导率可达 9000%;6BA 和噻苯隆(TDZ)在黄樟不定芽诱导中起着关键作用，诱导产生不定芽的最佳培养基为“MS 培养基 1 L+6BA10 mg+TDZ08mg+萘乙酸(NAA)005 mg”，分化率可达 8917%，不定芽数量达 4927 个;不定芽继代培养基中添加维生素 C(VC)和维生素 B2(VB2)可有效抑制褐化，最适培养基为“MS 培养基1 L+6BA05 mg+NAA005 mg+VC15 mg+VB220 mg”;“MS 培养基 1 L+6BA02 mg+NAA005 mg+VC15 mg+VB220 mg+香蕉泥(BH)15 g”最适于生根前壮苗培养;“05 倍的 MS 培养基 1 L+吲哚丁酸(IBA)10 mg+NAA05 mg”生根效果最佳，生根率达 8533%。建立的黄樟组织培养和植株再生体系可为工厂化良种繁育提供参考。关键词黄樟;愈伤组织;不定芽;壮苗;生根分类号S79223High Frequency Callus Induction and Plant egeneration of Cinnamomum porrectum/Liu Xinliang，Dai Xiaoying，Zhang Yueting，Zhang Ting(Jiangxi Academy of Forestry，Nanchang 330032，P China)/Journal of Northeast Forest-ry University，2023，51(3):4146，53The effects of different plant growth regulators on callus induction，adventitious bud induction，strong seedling cultureand rooting culture were studied with MS as basic medium and new branches germinated from axillary buds of young stemsof Cinnamomum porrectum as explants The optimum medium for callus induction was MS added with 10 mg/L 6benzyl-aminopurine(6BA)and 02 mg/L 2，4dichlorophenoxyacetic acid(2，4D)，and the induction rate reached 9000%6BA and thifenuron(TDZ)play key role in the induction of adventitious buds of C porrectum The optimal combinationof growth regulators to induce adventitious buds was MS supplemented with 10 mg/L 6BA，08 mg/L TDZ，and 005 mg/L naphthylacetic acid(NAA)，the induction rate was 8917%，and the number of adventitious buds was 4927 Adding vi-tamin C(VC)and vitamin B2(VB2)to adventitious bud subculture medium could effectively inhibit browning The opti-mum combination was added with 05 mg/L 6BA，005 mg/LNAA，15 mg/L VC，and 20 mg/L VB2 The most suitablecombination for strong seedling culture before rooting was added with 02 mg/L 6BA，005 mg/L NAA，15 mg/L VC，20mg/L VB2，and 15 g/L banana puree(BH)The rooting effect was the best in the medium of 1/2 MS added with 10 mg/LIBA and 05 mg/L NAA，and the rooting rate was 8533%KeywordsCinnamomum porrectum;Callus;Adventitious bud;Strong seedling;ooting黄樟(Cinnamomum porrectum(oxb)Kosterm)属樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)植物，主要分布于长江以南各省区1。黄樟的根、茎、叶、枝均富含精油，是我国开发天然香料的重要木本精油植物资源之一2。黄樟不同个体间精油含量及主要成分存在较大差异，其精油的多样性与多功能性符合国际上对日化用品在纯天然、功能性等方面的需求，具有重要的开发利用价值和市场潜力。自然界中，黄樟呈小规模居群散生，加之 20 世纪 50 年代前后“掘根截杆”方式的开发，造成了黄樟资源较大程度的破坏，可开发利用资源极少3。黄樟个体间或世代间精油性状显著变异，其精油成分与化学型研究常根据单个种群甚或单株来源，现有资源不足以满足其在香精香料产业发展中的应用，制约了不同化学型黄樟精油资源的开发利用45。目前黄樟优良种质的规模化繁殖方式主要为扦插繁殖，随着可持续发展理念的贯彻，创新高效繁育方法已成为当今黄樟天然香料产业发展的重中之重。植物组织培养具有繁殖系数高、育苗周期短、不受外界环境限制等特点，在种质资源保存、大量繁殖方面具有明显优势，广泛应用于植物新优特种质资源的保护和规模化繁殖6。利用组织培养技术繁殖黄樟优良种质资源，是解决短期内规模化繁殖黄樟种苗有效方法之一，对提升生产中精油品质具有重要意义。植物的离体再生途径包括腋芽萌发途径、间接器官发生途径和体细胞发生途径7。目前，关于黄樟组织培养的研究仅限利用带芽茎段为外植体直接发生方式繁殖，属以腋芽萌发为基础的离体培养，繁殖系数较低，关于诱导愈伤组织分化不定芽获取再生植株的间接器官发生途径研究尚未见报道89。相对于黄樟腋芽DOI:10.13759/ki.dlxb.2023.03.022萌发途径，间接器官发生途径具有取材少、再生性强、增殖率高、重复性强等优点，是保存黄樟优良种质资源和大规模扩繁的有效途径，再生体系还可为其遗传转化及体细胞杂交奠定基础。本研究以江西省黄樟良种“赣柠 3 号”半木质化茎段为材料，通过运用多种植物生长调节剂和有机添加物配比进行组织培养，诱导产生愈伤组织和不定芽，建立黄樟高频再生体系，为其下一步的遗传转化和开发利用提供参考。1材料和方法试验材料:采自江西省林业科学院黄樟基因资源库(2753N，11647E)的江西省黄樟良种“赣柠3 号”2 年生扦插苗。无菌芽体获取:2020 年 7 月中旬，选择黄樟单株上当年生半木质化茎枝为初始试材，用剪刀去除叶片后剪成 10 cm 左右小段，先用毛笔蘸清洗液刷洗表面污垢，后用清水洗去清洗液，放入空瓶，瓶口用纱布包扎，置流水下冲洗 2 h 左右，拿超净工作台上用体积分数 75%酒精消毒 45 s，后用质量分数01%的氯化汞试剂处理 6 min，倒出，加入质量分数10%的盐酸溶液摇荡 1 min，倒出，加入无菌水摇动冲洗 56 次，消毒处理后的材料用镊子取出，放在消毒好托盘滤纸上吸干水，一手用镊子捏住茎段，一手用消过毒的刀片切除茎段两端以及叶柄，分成带1 2 个腋芽的小段，接种到启动培养基(MS 培养基)中。愈伤组织诱导:待启动培养基中茎段腋芽萌发至 12 cm 时，去除叶片，将腋芽萌发的茎枝切成长短为 05 cm 左右的不带芽小段，接入愈伤组织诱导培养基，茎段平贴培养基表面(图 1A)，探索不同植物生长剂种类及质量浓度对茎节间段诱导愈伤组织的最适宜培养配方。以 MS 培养基为基本培养基，添加不同配比的 6苄氨基嘌呤(6BA，05、10、20mg/L)和 2，4二氯苯氧乙酸(2，4D，0、01、02 mg/L)，采用 2 因素 3 水平完全随机设计，筛选出适合愈伤组织诱导的植物生长剂质量浓度最佳配比10。每个培养皿接种 8 个茎间段、每个处理接种 5 个皿，重复 3 次，30 d 后统计茎间段愈伤组织诱导情况。愈伤组织诱导率=(诱导出愈伤组织的茎段数/接种的茎段数)100%。愈伤组织分化不定芽培养:挑选微黄愈伤组织团接种到愈伤组织分化不定芽的培养基，以 MS 培养基为基本培养基，添加不同配比的 6BA、萘乙酸(NAA)和噻苯隆(TDZ)，采用 3 因素 4 水平正交试验设计(L16(43)，表 1)，试验编号 116。每个瓶中放 5 团 0304 mm 大小愈伤组织，每个处理 5 瓶，重复 3 次。30 d 后统计愈伤组织发生脱分化形成不定芽的生长情况。愈伤组织分化率=(发生分化不定芽的愈伤组织团数/接入的愈伤组织团总数)100%。表 1愈伤组织分化不定芽培养正交试验各影响因素质量浓度梯度设计梯度6BA 质量浓度/mgL1NAA 质量浓度/mgL1TDZ 质量浓度/mgL11000205005023100100442005008继代培养过程不定芽增殖及防褐化:将愈伤组织已经分化的不定芽团接种到继代培养基中进行增殖及防褐化培养，所用培养基为“MS 培养基 1 L+6BA05 mg+NAA005 mg+维生素 C(VC，5、10、15 mg)+维生素 B2(VB2，10、20、30 mg)”，添加 VC和 VB2采用2 因素 3 水平完全随机设计。每瓶插 8 个芽团，每个处理 5 瓶，重复 3 次。30 d 后观察不定芽团生长情况，统计褐化率。褐化率=(发生褐化的不定芽数/接入不定芽总数)100%。不定芽壮苗培养:使用培养基“MS 培养基 1 L+6BA02 mg+NAA005 mg+VC15 mg+VB220 mg+香蕉泥(BH，0、5、10、15、20、30 g)”开 展 壮 苗 试验11。选择 10 个芽为 1 丛，每瓶接种 4 丛，每个处理 10 瓶，重复 3 次，30 d 后观察不定芽生长的情况，测量芽高并统计有效芽(芽高3 cm)数量。茎芽的根系诱导:经壮苗培养后，在不定芽丛中剪取 34 cm 长度的茎枝放入生根培养基中，以 05倍的 MS 培养基为基本培养基，添加不同配比的NAA(02、05、10 mg/L)和吲哚丁酸(IBA，02、05、10 mg/L)，采用 2 因素 3 水平完全随机设计。每瓶插入 10