基于核因子κB信号通路观察...方对溃疡性结肠炎小鼠的影响_苏晓兰.pdf

基金项目：国家自然科学基金项目（）；国家重大疑难病中西医协作试点项目（国中医药办医政发 号）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目（）作者简介：苏晓兰（.），女，博士，主任医师，研究方向：中医药防治胃肠疾病的临床与基础研究，：.通信作者：魏玮（.），男，博士，主任医师，研究方向：中医药防治胃肠疾病，：.基于核因子 信号通路观察清热化湿调枢方对溃疡性结肠炎小鼠的影响苏晓兰，卿香丽，张 涛，王 琳，张格知，姚梦茜，魏 玮，（中国中医科学院望京医院脾胃病科，北京，；功能性胃肠病中医诊治北京市重点实验室，北京，；成都中医药大学，成都，）摘要 目的：基于核因子（）信号通路，探讨清热化湿调枢方对溃疡性结肠炎（）小鼠的作用及机制。方法：只无特定病原体（）级 小鼠随机选取 只为正常组，其余小鼠均给予.葡聚糖硫酸钠（）水溶液建立 小鼠模型。模型评价后，只小鼠随机分为模型组、美沙拉嗪组、清热化湿调枢方高、中、低剂量组。后 组分别给予.、.、.（）清热化湿调枢方混悬液.灌胃；美沙拉嗪组给予.（）美沙拉嗪混悬液.灌胃；其余小鼠给予.纯水灌胃，均 次，干预 。干预过程中测量小鼠体质量，干预结束后计算疾病活动指数（），测量小鼠结肠长度，苏木精伊红染色后观察远端结肠组织病理学形态，测定结肠核因子（）和磷酸化 （）水平，计算 值，实时荧光定量（）检测结肠白细胞介素（）、肿瘤坏死因子（）、趋化因子（）的 水平。结果：与模型组比较，美沙拉嗪组、清热化湿调枢方高剂量组、中剂量组小鼠体质量增加、结肠长度一定程度恢复，结肠组织病理炎症减轻，干预前后 差值增加（均 .）；、值、的 水平降低（.）。结论：清热化湿调枢方能够改善 小鼠症状、修复结肠黏膜，机制可能与抑制 信号通路激活，从而抑制炎症有关。关键词 结肠炎；溃疡性结肠炎；清热化湿调枢方；结肠组织；核因子 信号通路；炎症介质；作用机制；实验研究 ，（，；（），；，）：（）（）：.（），.，.，.（），.（），（），（），（），（），（），（）（）：，（.），（.）：，；中图分类号：.；文献标识码：溃疡性结肠炎（，）是一种累及结直肠的慢性非特异性炎症，多数研究认为其发病与遗传、肠道菌群失调、免疫功能紊乱引起的炎症损伤相关。该病病程长，常呈反复发作，其治疗难以取得满意的结果，且随着服药时间延长，不良反应日益明显，已成为全球难治性疾病之一。葡聚糖硫酸钠（，）结肠炎动物模型被广泛用于研究 的病因、发病机制及药效等。核因子（，）信号通路是介导炎症的经典通路，该通路被激活后可引发广泛的炎症介质的转录，如白细胞介素（，）、肿瘤坏死因子（，），导致炎症损伤，在 的发病中起关键作用。清热化湿调枢方是治疗 的常用方，该方可提高治疗 的有效率，改善症状，减轻肠道炎症。基础研究表明，方中败酱草、木香具有抗炎作用，可降低 大鼠结肠组织、的水平，改善 大鼠结肠病理组织形态。但清热化湿调枢方对 诱导的 小鼠炎症介质的影响和作用机制尚不清楚。因此，本研究通过 诱导小鼠建立 模型，基于 信号通路，阐述清热化湿调枢方治疗 可能的作用机制。材料与方法.材料.动物 只 周龄雄性 小鼠，体质量（），无特定病原体（，）级，购于北京斯贝福生物技术有限公司，动物许可证号为（京）。饲养于中国中医科学院针灸研究所 级动物房。饲喂以实验动物普通饲料，不限制进食及饮水，光照和黑暗循环，室温 ，湿度 。本实验经中国中医科学院针灸研究所伦理委员会批准（伦理审批号：）。.药物葡聚糖硫酸钠（，美国，批号：）。用 电 子 天 平 称 取 溶 质.，溶解在 的纯水中，配成.的 溶液。造模第 天开始配液，根据小鼠数量和饮水量 （只），计算所需配液量，天配液 次，保证溶液新鲜。清热化湿调枢方的中药组成为乌梅 、败酱草 、秦皮 、儿茶 、黄连 、当归 等。将 剂生药折合为免煎颗粒 （由中国中医科学院望京医院颗粒药房提供）。用精密天平称取清热化湿调枢方颗粒.，溶于 纯净水中，即为高剂量清热化湿调枢方混悬液。取 高剂量溶液等比稀释及 倍稀释，分别得到中、低剂量混悬液。美沙拉嗪肠溶片（，德国，批号：），取.该药片，去外衣后溶于 蒸馏水中，即为美沙拉嗪混悬液。将配制的溶液 储备，使用前恢复常温，摇匀。.试剂与仪器 抗体（上海贸易有限公司，批号：）；重组 （）抗体（上海贸易有限公司，批号：）；（，美国，货号：）；（）（，瑞士，货号：）；引物（武汉擎科创新生物科技有限公司）。六一电泳仪电源（北京六一仪器厂，型号：）；其林贝尔水平摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：）；六一迷你电泳槽（北京六一仪器厂，型号：）；君意湿转转印系统转印槽（北京君意东方电泳设备有限公司，型号：）；荧光定量 仪（，瑞士，型号：）；超微量分光光度计（，美国，型号：）等。.方法.分组及造模 参照 教授的方法制备 结肠炎小鼠模型。先将 只 小鼠适应性喂养 ，随机抓取 只小鼠为正常组，剩余的 只小鼠自由饮用.水溶液 。疾病活动指数（，）评分用于评价造模成功与否。在造模结束后计算 评分，纳入 评分 分的小鼠。结果 只小鼠均造模世界中医药 年 月第 卷第 期成功。将 只小鼠随机分为模型组，清热化湿调枢方高、中、低剂量组，美沙拉嗪组，每组 只。.干预方法 参考中药药理研究方法学中给药剂量方法，计算小鼠给药剂量。从造模结束当天（第 天）开始分别予以清热化湿调枢方高、中、低剂量组小鼠.（）、.（）、.（）清热化湿调枢方混悬液.灌胃；给予美沙拉嗪组小鼠.（）美沙拉嗪混悬液.灌胃；正常组和模型组小鼠给予.纯净水灌胃。各组均给药 次，连续 ，期间不限制进食饮水。.检测指标及方法.评分干预结束后，参考 等的评估方法，根据小鼠体质量、大便性状和粪便隐血情况（每天均需记录），计算各组小鼠 评分。评分 （体质量下降分数 大便性状分数 便血分数）.结肠组织形态学观察 干预结束后，麻醉处死小鼠，分离小鼠结肠，测量结肠长度。光学显微镜观察结肠远端长约 组织的苏木精伊红（，）染色切片。.检测）结肠组织蛋白提取：在冰浴条件下，向磨碎的结肠组织加入新鲜配制的裂解液，离心（离心半径.，离心 ）后取上清，以 法定量分析蛋白浓度，并将上清液分装冻存备用。）：先后配置好 的分离胶和 积层胶，每孔上样，电泳。）转膜及抗体杂交：按“三明治法”用湿转法转膜，转膜后用 封闭液 封闭过夜。室温一抗（）水平摇床 ，大量 冲洗 次，次；加入室温二抗（），重复上述操作。）显影：将 显影液加于 膜上，曝光、显影、定影，用图像分析软件（）以 为内参，计算二者的相对表达量。.实时荧光定量（）检测结肠组织总 的提取依据 说明书进行，提取后用超微分光光度计测定总 浓度；根据 第一链 合成试剂盒说明书配置逆转录体系，用 仪合成；取.管，配置以下定量 体系：.、.基因引物.、逆转录产物.、双蒸水.，.预变性 后，.变性 ，.退火 ，.延伸 ，总共进行 个循环。以 为内参进行半定量分析，将得到的结果根据 法处理，特异性引物序列见表。表 引物序列目的基因引物序列（）：.统计学方法采用 .统计软件进行数据分析，计量资料以均数 标准差（?）表示。若计量资料同时满足正态分布（检验）和方差齐性（检验），组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 检验。若未同时满足上述条件，则采用（）检验。组内比较采用配对 检验。以 .为差异有统计学意义。结果.各组小鼠一般情况适应性喂养 期间，各组小鼠一般情况可，精神无异常。造模期间未出现小鼠死亡，所有小鼠均出现肛周血渍，且小鼠精神状态差、活动迟缓、喜蜷卧。干预结束后，各组小鼠一般情况均有恢复，仅模型组仍有部分小鼠活动迟缓。.各组小鼠体质量变化情况 干预前，与正常组比较，各组小鼠体质量均下降（均 .）。干预后，各组小鼠与干预前比较体质量均增加（均 .）。其中，模型组和清热化湿调枢方低剂量组小鼠体质量较正常组明显降低（均 .）。清热化湿调枢方高、中剂量组、美沙拉嗪组小鼠干预前后体质量差值明显高于模型组和正常组（均 .）。见表。.各组小鼠 评分比较干预前，模型组、美沙拉嗪组、清热化湿调枢方高、中、低剂量组小鼠 评分较正常组升高（均 .）。与干预前比较，干预后除正常组外，各组小鼠的 评分均降低（.）。干预后，与正常组比较，模型组、清热化湿调枢方低剂量组 评分均升高（均 .）；与模型组比较，清热化湿调枢方中剂量组、美沙拉嗪组 评分降低（均 .）。除模型组外，干预前后各组 评分差值均高于正常组（均 .）；美沙拉嗪组、清热化湿调枢方高剂量、中剂量组 评分差值明显高于模型组（均 .）。见表。，表 各组小鼠体质量变化情况（?，）组别干预前干预后干预前后体质量差值正常组.模型组.美沙拉嗪组.清热化湿调枢方高剂量组.清热化湿调枢方中剂量组.清热化湿调枢方低剂量组.注：与正常组比较，.；与模型组比较，.；组内比较，.表 各组小鼠 评分变化（?，分，）组别干预前干预后干预前后评分差值正常组.模型组.美沙拉嗪组.清热化湿调枢方高剂量组.清热化湿调枢方中剂量组.清热化湿调枢方低剂量组.注：与正常组比较，.；与模型组比较，.；组内比较，.各组小鼠结肠长度比较 药物干预结束后，与正常组比较，模型组、清热化湿调枢方低剂量组小鼠结肠长度较短（均 .），与模型组比较，各给药组结肠长度均有不同程度恢复，其中清热化湿调枢方中、高剂量组和美沙拉嗪组恢复较好（均 .）。见表，图。表 各组小鼠结肠长度比较（?，）组别结肠长度正常组.模型组.美沙拉嗪组.清热化湿调枢方高剂量组.清热化湿调枢方中剂量组.清热化湿调枢方低剂量组.注：与正常组比较，.；与模型组比较，.图 各组小鼠结肠长度 注：.正常组；.模型组；.美沙拉嗪组；.清热化湿调枢方高剂量组；.清热化湿调枢方中剂量组；.清热化湿调枢方低剂量组.各组小鼠结肠组织 染色结果正常组小鼠肠黏膜上皮无缺损，可见隐窝结构正常，杯状细胞分泌可。模型组小鼠结肠黏膜隐窝结构严重破坏，大量炎性细胞浸润，杯状细胞明显减少，黏膜下层充血、水肿。美沙拉嗪组和清热化湿调枢方高剂量组小鼠结肠黏膜缺损情况较模型组明显修复，杯状细胞增多，隐窝破坏极少，较少炎性细胞浸润。清热化湿调枢方中剂量组小鼠结肠组织部分黏膜中断，隐窝结构破坏和炎性细胞浸润较少。清热化湿调枢方低剂量组仍可见多处结肠组织黏膜受损，隐窝结构破坏，炎性细胞浸润。见图。图 各组小鼠结肠组织 染色结果（染色，）注：.正常组；.模型组；.美沙拉嗪组；.清热化湿调枢方高剂量组；.清热化湿调枢方中剂量组；.清热化湿调枢方低剂量组.各组小鼠 检测结果比较药物干预结束后，模型组、清热化湿调枢方中剂量组世界中医药 年 月第 卷第 期 较正常组降低（均 .）；美沙拉嗪组、清热化湿调枢方高剂量组 较模型组均增加（均 .）；清热化湿调枢方中剂量组与美沙拉嗪组比较 降低（.）。见表，图。与正常组比较，各组小鼠 均升高（均 .）；与模型组比较，各组 均降低（均 .）；与清热化湿调枢方低剂量组比较，清热化湿调枢方中剂量、高剂量、美沙拉嗪组 均降低（均 .）。见表，图。与正常组比较，除美沙拉嗪组，其余各组小鼠 比 值 均 升 高（均 .）；与模型组比较，美沙拉嗪组、清热化湿调枢方高剂量组、中剂量组 比值均降低（均 .）；美沙拉嗪组与清热化湿调枢方低剂量组比较，比值更低（.）。见表，图。图 各组小鼠 检测结果 注：.正常组；.模型组；.美沙拉嗪组；.清热化湿调枢方高剂量组；.清热化湿调枢方中剂量组；.清热化湿调枢方低剂量组.各组小鼠 检测结果比较 干预结束后，与正常组比较，除美沙拉嗪组外，各组小鼠、的 水平均升高（均 .）。与模型组比较，美沙拉嗪组、清热化湿调枢方高剂量组、中剂量组炎症介质和趋化因子均降低，差异均有统计意义（均 .）。与美沙拉嗪组比较，清热化湿调枢方低剂量组各项指标更高（均 .）；且与美沙拉嗪组比较，清热化湿调枢方中剂量组 的 也较高（均 .）。与清热化湿调枢方低剂量组比较，美沙拉嗪组、清热化湿调枢方高剂量组 的 更低（均 .）。见表。讨论根据患者腹痛、腹泻、脓血便等临床表现，归属于中医学“休息痢”“久痢”“泄泻”的疾病范畴。湿