2022年医学专题—考马斯亮蓝法测定蛋白质含量.ppt

实验(shyn)三 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量,一.目的:掌握考马斯亮蓝G250染色法测定蛋白质的原理和操作；了解(lioji)分光光度法测定蛋白质的几种方法；进一步熟悉分光光度计的使用。,第一页，共八页。,二、原理分光光度法测定蛋白质的几种(j zhn)方法,1、双缩脲法：在碱性条件下，蛋白质能与铜离子结合形成紫红色络合物，540nm，1-10g/L。与蛋白质的相对分子量及氨基酸组成无关，快速，不受硫酸铵干扰。灵敏度低，需要样品(yngpn)量大；2、Folin-酚试剂法（Lowry法）：在碱性条件下，蛋白质首先与铜离子形成紫红色络合物，该络合物以及Tyr，Trp残基还原Folin试剂，产生深蓝色。750nm，0.03-3g/L或500nm，0.05-0.5g/L。灵敏度高，需要样品量少；但干扰因素多，操作试剂配制麻烦，不同蛋白质之间差异大。3、考马斯亮蓝染色法：在酸性环境下，棕红色的考马斯亮蓝与蛋白质通过疏水力相结合，蓝色化合物，595nm，颜色深浅与蛋白质含量成正比。0.01-1g/L，灵敏度高，需要样品量少，不同蛋白质之间差异大。4、紫外分光光度法：280nm，不同蛋白质之间差异大,第二页，共八页。,三、仪器(yq),721分光光度计（使用(shyng)前预热20min）；移液管：,第三页，共八页。,四、实验(shyn)试剂,标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质0.1mg/mL的标准蛋白溶液；染色(rns)液（考马斯亮蓝G250溶液）：称取0.1mg考马斯亮蓝G250，溶于50 mL 90乙醇中，加入85的磷酸100 mL，蒸馏水定容到1000 mL，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。待测蛋白质溶液,第四页，共八页。,五.实验(shyn)操作,1、标准曲线(蛋白质含量为00.1mg/mL)的绘制:利用1，2，3，4，5，6号试管数据绘制。1号试管调零。2、样品(yngpn)提取液中蛋白质浓度的测定 7，8好试管数据取平均值。,调0,第五页，共八页。,注意事项:,如果测定要求(yoqi)很严格，可以在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为这段时间内颜色最稳定。测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。,第六页，共八页。,思考题,比较该法与其他几种(j zhn)常用蛋白质的定量测定方法。,第七页，共八页。,内容(nirng)总结,实验三 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。实验三 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。1、双缩脲法：在碱性(jin xn)条件下，蛋白质能与铜离子结合形成紫红色络合物，540nm，1-10g/L。与蛋白质的相对分子量及氨基酸组成无关，快速，不受硫酸铵干扰。2、Folin-酚试剂法（Lowry法）：在碱性(jin xn)条件下，蛋白质首先与铜离子形成紫红色络合物，该络合物以及Tyr，Trp残基还原Folin试剂，产生深蓝色,第八页，共八页。,