枸杞多糖的提取与分离研究分析生物技术专业.docx

摘要 为了研究枸杞多糖在枸杞中的提取分离更好的方法和提取得率含量最高的方法，本文以单因素试验的基础上，设计正交试验，对枸杞中多糖提取法的工艺条件进行优化，并对获得的优化参数进行了放大验证，确定热浸提法最佳工艺提取条件是料液比为1:15，浸提温度为95℃，浸提时间为3小时，得到枸杞多糖的得率为2.56%。该提取工艺条件，是一种提取成本低、枸杞多糖得率较高的方法，结果令人满意。 关键词：枸杞多糖，提取分离，含量测定 Abstract InordertostudytheextractionandseparationofChinesewolfberrypolysaccharidesinlyciumbettermethodandobtainedthehighestrateofcontent,inthispaper,onthebasisofsinglefactorexperiment,orthogonalexperimentdesign,intheChinesewolfberrypolysaccharideextractionprocessconditionswereoptimized,andtoobtaintheoptimizedparametersfortheamplification,ishotextractionoptimumextractionconditionsweredeterminedandsolid-liquidratiois1:15,leachingtemperatureis95℃,leachingtimeis3hours,theyieldofLBPis2.56%,thepolysaccharidecontentofLBPwas43.35%.Itisamethodwithlowextractioncostandhighyieldoflyciumbarbarumpolysaccharide. Keywords：lyciumbarbarumpolysaccharide,Extractionandseparation,Contentdetermination 目录 摘要 Ⅱ Abstract Ⅲ 1绪论 1 1.1研究背景 1 1.2枸杞多糖的简介 2 1.3多糖的提取分离方法 2 1.3.1多糖的提取方法 2 1.3.2多糖的分离方法 3 2实验部分 6 2.1实验材料与仪器 6 2.1.1实验材料 6 2.1.2实验试剂 6 2.1.3实验仪器 6 2.2热水浸提枸杞多糖 6 2.2.1提取工艺 6 2.2.2构杞多糖中多糖含量测定方法 7 2．2.3热水浸提枸杞多糖的研究 7 2.2.3.1单因素实验的结果 7 2.2.3.2热水浸提枸杞多糖正交试验设计的结果 9 2.3本章小结 10 3研究结论 11 参考文献 12 致谢 15 IV 1绪论 据《神农本草经》记载，枸杞的功效十分强大，一直以来就有枸杞可以补气益血，清肝明目的效应，也因此广受人们关注。从古至今，以枸杞为养生食材的记载屡见不鲜，而就在最近的研究当中，人们也发现，枸杞中的有效成分，如枸杞多糖、枸杞蛋白质等对人体都具有很强的补充和修复作用，它们可以提高人体免疫力，进一步抵抗疾病，延缓衰老。有部分研究人员认为，提取枸杞多糖的方法数不胜数，本文就采用了其中几种方法并分析其结构与化学性质，借以为后来人提供新的参考思路与经验。在1981-2010年期间，关于枸杞和枸杞多糖的新型治疗剂就有八百七十六种，在这其中，天然产物和天然类似物与人工产物的比例几乎已经达到了1:1的程度。而对于天然产物的提取与分离，就是探究治疗剂治疗效果与研究难度的重点。 中药产品常常成分复杂，根据现代精密仪器分析，常常可以达到成千上百种。其中也包含了各种天然产物。但有效的活性成分，往往只有其中的部分化合物。要想完全提取并明白天然产物的有效成分，就需要对天然产物进行分离与质量分析控制。单糖与单糖结合、单糖与蛋白质结合都可以构成生物大分子，并广泛存在于人体与自然界当中，起到其至关重要的作用，如信息识别、能量传递、贮存等。多糖的应用领域非常广泛，比如食品和保健品领域。 枸杞多糖的药理和生物分子具有促进身体健康的作用，医疗功效也非常不错，是一种相当重要的生物活性物质。近年来医学界和营养学界的研究热门，就是对多糖的探索研究。枸杞多糖的提取分离研究是一项颇有意义的工作，也是一项非常艰巨的工作。 1.1研究背景与研究目的 天然产物成分复杂，含有多种生物活性成分和营养成分，包括蛋白质、多糖、维生素、生物碱、挥发油、黄酮类化合物、糖苷和萜烯[1]。活性大分子与小分子的分离比较容易，这其中大分子要想完全分离出来，并能应用于生产实践，就需要攻克其分离纯化的技术难关。 关于多糖的提取，最重要的步骤就是得率与纯度。提高多糖的得率，不仅要优化各种条件，还要需要保证多糖的生物活性不被破坏。水、酸溶液、碱溶液等，都是多糖提取的常用溶剂[2][3][4][5]. 因为热水获取成本低，多糖在热水当中的溶解度也较高，因此热水就变成提取多糖时最重要的溶剂之一。但是由于部分多糖含有醛酸，因此，在提取这部分多糖时，就需要采用碱溶液。在目前的研究当中，新的提取分离技术屡见不鲜，如西洋参多糖以超声波辅助提取 [6]，大蒜油以超临界CO2逆流萃取等[7],但是这些提取方法对设备等条件有很高的要求,其过程的复杂性也难以满足工业生产需要。部分研究发现，枸杞多糖作为枸杞的有效成分之一，其效用十分广泛，可以提高人体免疫力，延缓衰老，并且有降低血脂的影响和抗衰老的作用[8][9]。并且有降低血脂的影响和抗衰老[8][9]。枸杞多糖产品现在粗多糖杂质较多,水溶性清算解决方案有限程度是不够的,所以不能满足美国食品和药物相关需求开发适当的卫生保健产品和临床应用的药物,所以未来的枸杞多糖提取天然植物药的流程优化,结构特征分析是必要的,只有很好地了解了相应结构的性质，才能为新药和保健品的开发提供可靠的理论基础和实践指导。 1.2枸杞多糖的结构和理化性质 1.2.1枸杞多糖的结构 枸杞多糖作为一种常见化合物，其分子量的测算、多糖的种类、腺苷键的数量、长度、位置、异形、连接方式等等都在研究的范围之内。有学者在其研究著作中表明，枸杞多糖实际上是由由1→3连接和1→6连接的3.33:53.55:39.35的阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖酸所组成。枸杞多糖结构稳定，骨架为1→3连接半乳糖，lblp5-a-oli为高度分枝多糖。在测量时采用阿兰二（nl=0-6，n2=0-8，n3=0-1）来进行分析。在测量前需要进行柱分析来纯化，进一步得到二级组分与结构，在结构分子当中含有大量的氨基和氨基，它由五个单糖残基组成。初级结构由α-D-吡喃糖残基组成。 1.2.2枸杞多糖的药理功能 生殖系统保护功能: 中药中常用枸杞治疗不孕症。在实验中，应用枸杞多糖的抗氧化作用，就可以在一定程度上抑制自由基的裂变，抑制其致使细胞色素衰老的强制性表达和H2O2酶的释放，在一定程度上降低鼠睾丸细胞破裂和DNA的氧化，延长小鼠精原上皮细胞热损伤细胞的体外死亡时间，实现对小鼠生殖系统的保护。枸杞多糖可以在一定程度上促进 睾 丸 生 殖 细胞的发育，并促进和调节下丘脑、下垂体的激素分泌。同时也能降低高温和对精母细胞的损伤，受损的精原细胞染色体也受到保护作用。 抗氧化和抗衰老：在枸杞多糖的作用下，自由基的应激反应会被多糖打断并抑制，因此枸杞多糖可以起到抗氧化的作用。实验室研究发现，枸杞多糖还可以抑制H2O2酶的产生，表现出消除自由基、降低酶活性的作用。而且，其还原能力、清除能力也是枸杞多糖的拿手好戏。对游离过氧化氢对小鼠红细胞溶血能力和铁离子螯合能力的抑制作用也有显著表现。实验中用辐射照射大鼠肝脏颗粒悬浮液或钙多糖颗粒悬浮液，结果显示，辐射引起的钙蛋白损失被钙多糖抑制，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶也被抑制，这种抑制关系呈现线性，比维E的影响更大。在部分研究当中，多糖多数都由枸杞脱色、提水，然后再通过酒精萃取沉淀所获得的大分子、总多糖化合物。罗琼在其相关文献中显示：枸杞水提取物的体外抗氧化活性高于提水和酒精。近年，有学者已将提取多糖的蛋白质水解，并以死亡玛瑙的柱分离，得到中性多糖及三种酸性多糖等四种成分。比较了4种成分与非含酒精水提取物、透析治疗多糖、脱蛋白溶多糖、粗多糖的抗氧化活性。在研究当中，人们发现，这些蛋白（除去顺式和DDP）都具有去除自由基的功效，主要去除的自由基包括：2,2-亚氮-二-二(3-乙基-6-磺酸)自由基、超氧化物阴离子和羟基自由基的功能。 免疫调节作用：枸杞多糖可以起到免疫调节的作用，在实验当中，一般采用离子交换色谱法来探究其相对作用，通过柱实验的分离与探究，可以得到的是蛋白质+多糖的结合，这种复合多糖具有一定程度的免疫刺激作用。实验表明，枸杞多糖在增加人外周血单核细胞I和TNF的表达方面都具有显著作用，在该实验中，RNA与蛋白质水平都与枸杞多糖呈现出显著相关的剂量依赖性，从这个角度来说，枸杞多糖是可以增强免疫力的。钙多糖的存在可以抑制肿瘤的生长，同时增加一部分巨噬细胞的吞噬能力、分泌能力，从而影响RNA的转录与表达，进一步引起脂质过氧化的减少，对生物体起到免疫调节的保护作用。有部分实验表明，枸杞多糖在调节小鼠骨髓树突状细胞的表型和功能成熟度方面都都有显著效应。树突状细胞是体内重要的抗原呈现细胞，在引发初期免疫反应中起着独到的作用。 抗肿瘤：一些研究人员发现，枸杞多糖可以起到抗肿瘤的效果，但是其作用机制尚不明确。有些学者认为枸杞多糖之所以能够抗肿瘤，是由于其激活的免疫体制，有些学者则认为是通过增强人体自免疫，降低脂质过氧化作用来达到抗肿瘤的效果。但是目前，这两种说法都没有可靠的证据来证明其观点。也有人认为，枸杞多糖之所以能够抗肿瘤，是因为其可以调节Ca+强度，相关的实验有对肝癌细胞株的研究。还有人认为，枸杞多糖在某种程度上可以抑制细胞增殖，从而降低癌变速率，并在有丝分裂的S期诱导细胞凋亡，进而达到抗肿瘤的功效。人体内存在的钙多糖还可以抑制癌细胞的生长，这一点也在人前列腺癌当中得到了证明。在细胞当中，RNA量与Ca+的分布也有可能会抑制细胞系的生长，与此同时剂量-时间反应关系，这一关系的存在会导致癌细胞DNA破裂和细胞的凋亡。根据实验室实验表明，钙多糖还可以在一定程度上抑制裸鼠的生理结构与生长习性。根据研究发现，枸杞多糖还可以诱发肝癌细胞癌变。 调节血脂和低血糖：吴等人在其相关研究中发现枸杞多糖的存在在非胰岛素依赖型糖尿病大鼠的实验中可以显著降低血糖水平，并进一步提高血清当中的含量，从而减少外周淋巴细胞。在糖尿病家兔实验中，枸杞多糖可以显著降低由四氧嘧啶诱导的血脂与血糖水平。据研究，枸杞多糖的作用剂量在20-50毫克，就可以对糖尿病患者起到一定程度的保护肝脏、肾脏等内脏组织的作用，因此，我们可以说，枸杞是一种良好的有发展前景的调节血脂与低血糖物质。 抗辐射：枸杞多糖在一定程度上能起到抗辐射的作用，可以促进x射线和卡布铂化疗，然后进一步诱导小鼠外周血液图像的恢复，在这一基础上，刺激人外周血液单核细胞，重组粒细胞菌落刺激因子；辐射射线主要伤害的是小鼠肝细胞中的膜结构，多糖可减少这种损伤。它显著地改善了线粒体糖蛋白的丢失，改善了由射线引起的肝细胞、过氧化氢酶和的失活。它的抗辐射功能比生育酚更明显。 保护神经：香港大学的余等人发现，枸杞提取物通过抵抗神经细胞内质网的应激水平，在某种程度上都可以保护神经，枸杞多糖可以对淀粉样肽当中存在的麻痹神经系统的神经毒性起到抑制作。所谓淀粉样肽，是指阿尔茨海默氏病的病因之一，是引起它发病的关键因素。而枸杞多糖的存在，在抑制相对蛋白酶活性的基础上，可以同时降低乳酸脱氢酶的活性，从而抑制c-垃圾氨基端激酶的磷酸化，起到阻止细胞凋亡