2022年医学专题—细胞自噬介绍与相关研究.ppt

细胞(xbo)自噬介绍与相关研究,崔龙萍,第一页，共五十三页。,程序性死亡和非程序性死亡细胞凋亡(dio wn)：称为型程序性细胞死亡。细胞坏死：是细胞对外界损伤刺激的一种非程序性死亡方式。细胞自噬？,细胞(xbo)死亡,三者有什么(shn me)区别呢？,第二页，共五十三页。,凋亡：细胞皱缩、体积缩小；部分细胞器、核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成凋亡小体，从细胞表面出芽脱落，最后被具有吞噬功能的细胞吞噬；磷脂酰丝氨酸外翻；细胞核染色质浓缩、边缘化、染色质DNA断裂。坏死：细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。自噬：部分细胞器肿大，在细胞质中形成包裹细胞质内容物的双层膜囊泡结构，再与溶酶体结合(jih)实现内容物的降解。,第三页，共五十三页。,第四页，共五十三页。,自噬（autophagy）：又叫做型程序性细胞死亡,是指细胞利用溶酶体降解、选择性地清除自身受损、衰老或过剩的生物大分子和细胞器，释放(shfng)出游离小分子供细胞回收利用的正常动态生命过程。被认为是机体的一种自我保护机制,自噬概念(ginin),第五页，共五十三页。,1、应激功能 是细胞在饥饿条件下的一种存活机制2、防御功能 当细胞受到致病性微生物感染时，可起到防御作用3、维持细胞稳态 在骨骼肌和心肌可帮助细胞浆成分进行更新4、延长寿命 如果细胞自噬受损衰竭，细胞损伤就会堆积、累加，产生老化。长期适当减少热量的摄入，可以延长寿命。5、控制细胞死亡及癌症 决定(judng)细胞自噬导致细胞死亡，还是维持细胞存活的因子尚不完全清楚。所以，细胞自噬与细胞死亡之间的因果关系还没有最后定论。,生物学意义(yy),第六页，共五十三页。,1956年,Clark和 Novikoff用电镜在鼠肾组织中观察到包含线粒体等胞质结构的膜性结构。将其命名为致密小体，且在这个独立的膜结构中发现了溶酶体酶 1962年，Ashford和Porter在老鼠的肝细胞中，观察到包含半消化的线粒体和内质网的膜囊泡结构，且在囊泡内发现了胰高血糖素1963年，Duve将这种细胞中存在的包裹细胞质的膜泡发生现象定义为自噬。并指出自噬发生在正常细胞内且与溶酶体相关联 1997年，第一个酵母菌自噬基因被日本(r bn)科学家克隆得到，命名为ATG11998年，第一个哺乳动物自噬基因被美国科学家克隆得到，命名为Beclin12007年，召开了第一次国际自噬会议2007-至今，随着越来越多的自噬基因被克隆，对于自噬的研究报道也越来越多，尤其是在哺乳动物细胞自噬方面的研究,自噬发展(fzhn),第七页，共五十三页。,分子伴侣介导自噬（CMA,chaperone-mediated autophagy）CMA不涉及囊泡的运输，而是通过有着特异性肽链的细胞质蛋白在分子伴侣复合物的作用下与溶酶体膜蛋白感受器Lamp2a结合后进入溶酶体腔，然后被溶酶体酶消化。小/微自噬（Microautophagy）溶酶体/液泡表面的膜直接吞没某些细胞器或者蛋白，然后膜内陷、脱离(tul)，最终形成一个包含了细胞质内容物的内部囊泡。大/巨/宏自噬（Macroautophagy）是我们平常所说的自噬，通过形成具有双层膜结构的自噬体包裹胞内物质，最后自噬体与溶酶体融合。包含杯状体（Phagophore）、自噬体（Autophago-some）、自噬溶酶体（Autolysosome）的形成和囊泡内含物的降解（Degradation）四个过程,自噬分类(fn li),第八页，共五十三页。,形成(xngchng)过程,第九页，共五十三页。,Atg1/ULK1激酶(jmi)复合物（自噬的诱导阶段，受mTOR的调控）,Atg1能与Atg13、Vac8、Atg17和Cvt9等蛋白形成Atg1复合物。营养(yngyng)条件充足时，Atg13过度磷酸化，与 Atg1的结合受阻，然后Atg13与Vac8结合，Atg1与Cvt9结合后一起调控Cvt途径。相反，营养(yngyng)不足时，Atg13部分去磷酸化形成Atg13-Atg1复合物，Atg17再与Atg1-Atg13复合物的Atg1结合形成复合物参与自噬。ULK1是Atg1在人类细胞中的同源物,第十页，共五十三页。,两条泛素化系统（自噬体的形成(xngchng)：囊泡的延伸和完成）,Atg12-Atg5 Atg16 泛素激活酶E1（Atg7）的半胱氨酸残基，在ATP的作用下，与Atg12 碳末端的甘氨酸残基之间形成(xngchng)硫酯键。泛素激活酶E2（Atg10）的半胱氨酸与Atg12碳末端的甘氨酸残基形成新的硫脂键，释放出Atg7。最终，Atg12碳末端的甘氨酸与Atg5 的-赖氨酸氨基形成异肽键，释放出Atg10，形成Atg12-Atg5复合物（不可逆）。Atg16碳末端的螺旋区寡聚化后与Atg12-Atg5复合物结合，形成一个350KDa大小的复合物（Atg12-Atg5 Atg16），Atg16仅仅与Atg5结合，并不结合Atg12。Atg12-Atg5 Atg16复合物对于隔离膜的延伸是必不可少的。,第十一页，共五十三页。,Atg8/LC3-PE(磷脂酰乙醇胺)复合物 半胱氨酸蛋白酶Atg4作用于Atg8，Atg8失去一个精氨酸残基，暴露出碳末端的甘氨酸残基后，在ATP的作用下，被Atg7（E1）激活，然后再与Atg3（E2）结合，形成Atg8复合物。最后，Atg8不再与其它蛋白结合，而是与PE结合形成Atg8-PE复合物。Atg8与PE的酯化反应，使Atg8的构象(u xin)发生变化，参与自噬的膜动力学。Atg4可以破坏脂蛋白的连接，使Atg8-PE去结合，从而使胞浆中Atg8的量增加。Atg8-PE的结合与去结合之间的循环对于自噬的正常过程非常重要。LC3（微管相关蛋白）是Atg8在哺乳动物细胞中的同源物，因此，LC3可用来作为检测哺乳动物细胞自噬的标志性蛋白。,第十二页，共五十三页。,Vps34/PI3K Atg6/beclin1(自噬体形成(xngchng)的早期阶段有着重要的作用),Vps34与蛋白激酶Vps15结合形成稳定的Vps34-Vps15复合物，定位于细胞质膜上。Vps34-Vps15复合物存在两种形式，涉及多种细胞膜转运途径(tjng)。Vps34-Vps15与Atg6和Atg14组成的I型复合物调控自噬。Vps34-Vps15与Atg6和Vps38组成参与PAS途径(tjng)的II型复合物。在哺乳动物细胞中，PI3K和beclin1分别是酵母菌Vps34和Atg6对应的同源物。,第十三页，共五十三页。,第十四页，共五十三页。,mTOR/TOR的介绍(jisho),mTORC1 信号(xnho)通路是多条信号(xnho)通路的汇聚点，通过对上、下游信号(xnho)的来传导影响细胞自噬，是目前研究最多的信号(xnho)通路。,第十五页，共五十三页。,PI3K/Akt/mTOR通路(tngl),激活的 Class PI3K 能在细胞中产生第二信使 PIP3，PIP3 在磷脂酰肌醇脂依赖性蛋白激酶 1(PDK1)的协助(xizh)下，激活 AKT。激活的 AKT 能够抑制 TSC1/2 复合物，从而激活 mTOR,抑制细胞自噬。胰 岛 素 样 生 长 因 子 IGF1 就是通过 PI3K/Akt/mTORC1 通路调节细胞自噬水平的,第十六页，共五十三页。,AMPK通路(tngl),AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶)是能量代谢变化的感受器,在自噬发生的调控中也发挥着重要的作用。低ATP水平状态下(如饥饿或缺氧)AMPK能感受AMP的水平变化而激活,从而磷酸化TSC2,加剧TSC1/2对Rheb的抑制,最终使mTOR的活性被抑制,诱导细胞发生自噬AMPK还可以通过直接磷酸化Raptor，使Raptor脱离mTORC1复合体，进而抑制mTORCI的活性营养缺乏会促进AMPK与ULK1的PS结构域结合，使ULK1的Ser/Thr丰富(fngf)区多位点磷酸化，从而激活ULK 1，直接调节自噬。,第十七页，共五十三页。,p53通路(tngl),p53 在细胞核中：(1)p53 能通过sestrin1/2 蛋白激活 AMPK-mTORC1 信号(xnho)通路，从而抑制 mTORC1，上调细胞自噬水平。(2)p53 能通过激活 DAPK1，磷酸化 Beclin-1,促进细胞自噬。(3)p53 能通过激活抗凋亡蛋白 BCL-2 家族(Bad、PUMA、Bax、BNIP3)，解除 Bcl-2/Bcl-xL 与 Beclin-1 之间的抑制作用而上调细胞自噬(4)p53 能激活 DRAM1(损伤相关自噬调节因子)，通过编码一种溶酶体蛋白，从而上调细胞的自噬水平p53 在细胞质中：p53 缺失的癌细胞中，细胞自噬水平上调，且细胞质中重新载入p53 能下调细胞自噬水平。因此，p53 在细胞质中能够发挥抑制细胞自噬水平的功能。,p53是一种(y zhn)重要的抑癌基因，对自噬的调控作用是双重的，取决于在细胞内的定位，核内p53促进自噬，胞浆内p53抑制自噬。,第十八页，共五十三页。,Amino Acids通路(tngl),氨基酸代谢与 mTORC1：氨基酸作为(zuwi)细胞自噬的终产物可负反馈调节细胞自噬，同时外源性的支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)的摄入也能影响细胞自噬的水平。研究表明，当亮氨酸浓度升高时，能激活 mTORC1，抑制细胞自噬,第十九页，共五十三页。,PI3K通路(tngl),型磷脂酞肌醇3磷酸激酶（PI3K)是一个正调控蛋白(dnbi)，它能够磷酸化磷脂酞肌醇(PI),生成3-磷酸磷脂酞肌醇（PI3P)，而后PI3P利用胞质中的蛋白质形成自噬体膜。PI3K也能与Beclin-1形成复合体，该复合物在自噬体形成的起始阶段起重要作用。,第二十页，共五十三页。,形态学方法透射电镜（链接）Monodansylcadaverine(MDC)染色（链接）Autophagy的特异(ty)标志物荧光定位（链接）LC3-II的检测（链接）其它自噬调控物,第二十一页，共五十三页。,透射电镜,细胞的自噬现象最初(zuch)也是通过电子显微镜发现的。自噬体：由包裹未吞噬降解的胞浆物质、细胞器的双层膜结构组成。自噬溶酶体：由单层膜结构组成，其中包裹着处于不同降解阶段的胞浆成分。,第二十二页，共五十三页。,MDC 染色(rns),Monodansylcadaverine(MDC，单丹磺酰戊二胺)是一种荧光染料，被用作自噬泡的示踪剂 MDC阳性信号主要聚集于核周区域，而自噬体却均匀分布于胞浆内。MDC 是嗜酸性染色剂,可能显示晚期内吞体，两性体和溶酶体阵,而自噬体多呈中性，故自噬前体和有的自噬体可不(k b)被着色,故MDC 染色的特异性不高,第二十三页，共五十三页。,荧光(ynggung)定位,GFP-LC3单荧光自噬指示体系：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。但是绿色斑点增多并不一定代表自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻。mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系：GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是稳定的荧光表达(biod)基团，不受外界影响。由于自噬小体进入第二阶段后，与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，可以导致PH下降，GFP淬灭，因此，GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，GFP越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。mRFP是一直稳定表达的，因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。,第二十四页，共五十三页。,LC3-II的检测(jin c)（western blot）,细胞中新合成的LC3经过加工，成为胞浆可溶性LC3-I，后者