2022年医学专题—第3章-植物组织培养与细胞..(1).ppt

第3章 植物(zhw)组织培养与细胞培养,东北大学生物(shngw)技术研究所,第一页，共一百一十四页。,3.3 植物(zhw)组织与器官培养,3.3.1 植物组织培养的定义与分类3.3.2 重要概念3.3.3 细胞分化(fnhu)和形态建成3.3.4 植物组织培养的基本步骤3.3.5 植物组织器官培养3.3.6 植物组织培养的应用3.3.7 人工种子3.3.8 植物组织与器官的生物反应器培养3.3.9 植物组织与器官培养存在的问题,第二页，共一百一十四页。,3.3.1 植物组织培养的定义(dngy)与分类,1.定义 植物组织培养(plant tissue culture)是指在无菌条件下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等）、组织（如花药组织、胚乳、皮层等）、胚胎（如成熟和未成熟的胚）、原生质体等培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者(huzh)长成新的完整植株的一种实验技术。其理论基础是细胞的全能性。,第三页，共一百一十四页。,2.分类根据外植体种类的不同，组织培养可分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。根据培养方法的不同，组织培养可分为：微室培养、平板培养、悬浮培养、液体培养、固体培养等。根据培养的功能性的不同，组织培养可分为：再生体系(tx)、离体受精、突变体选择、体细胞杂交等。,第四页，共一百一十四页。,3.3.2 重要(zhngyo)概念,全能细胞（totipotent cell)愈伤组织(zzh)(callus)外植体(explantation)继代培养(secondary culture)胚胎培养(embryo culture)脱分化（dedifferentiation）再分化（redifferentiation)茎尖培养 无性繁殖系(clone)器官发生（organogenesis)胚状体（embryoid),第五页，共一百一十四页。,全能细胞（totipotent cell)：能够表达生物体基因组的任何一种基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞，进而发育为一个完全相同生物体。愈伤组织(callus)：在离体培养(piyng)过程中由外植体组织增生的细胞产生的具有分生能力的一团不规则的疏散排列的薄壁细胞。外植体(explant)：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料，可以是器官、组织和原生质体等。继代培养(secondary culture)：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织.芽等）。,第六页，共一百一十四页。,胚胎培养(embryo culture):包括原胚和成熟胚培养、胚乳培养、胚珠和子房(未授粉或已授粉的)培养，可用于研究胚胎发生以及影响胚生长的因素；用试管受精或幼胚培养可获得种间或属间远缘杂种，因此它也是研究生殖生理的有用方法；胚乳培养是研究胚乳的功能、胚乳与胚的关系，以及获得三倍体植株的一个手段。脱分化（dedifferentiation）:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程。再分化（redifferentiation):脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成(xngchng)各类组织和器官的过程。,第七页，共一百一十四页。,茎尖培养:较小的仅带几个叶原基或少量幼叶的茎端部分(b fen)的培养。通常用110mm大小的外植体来加速植物的无性系繁殖。无性繁殖系(clone)：由同一个外植体反复进行继代培养后所得一系列的无性繁殖后代。器官发生（organogenesis)：在组织培养中或悬浮培养中，由培养物到显示有自然的器官形成，如形成芽或根的现象。胚状体（embryoid)：在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。,第八页，共一百一十四页。,3.3.3 植物细胞分化(fnhu)和形态建成,一般植物通过细胞或组织培养达到再生(zishng)目的要经过两个步骤：(1)培养的植物细胞或组织的脱分化，形成愈伤组织；(2)有新形成的愈伤组织形成一些分生细胞团，随后又由其分化成不同的器官原基（如根原基、叶原基等）。,第九页，共一百一十四页。,脱分化后的细胞进行再分化的过程有两种不同(b tn)的方式：（1）器官发生方式：其中芽和根在愈伤组织的不同部位分别独立形成，具有单极性结构。（2）胚胎发生方式：在愈伤组织表面或内部形成很多胚状体，它们类似于合子胚，具有双极性结构。,魔芋(my)胚状体,第十页，共一百一十四页。,通过胚状体途径产生再生植株有3个显著优点：（1）在一个培养物上所能产生的胚状体数目往往比不定(bdng)芽数目多；（2）胚状体形成的速度快；（3）胚状体结构完整，一旦形成，一般都可以直接萌发形成小植株，因此成苗率高。,第十一页，共一百一十四页。,3.3.4 植物(zhw)组织培养的基本步骤,以胡萝卜为例，介绍植物组织培养的一般过程(guchng)（图解）：（1）培养材料的采集（2）培养材料的消毒（3）制备外植体（4)接种和培养（5）组培苗的练苗和移栽,第十二页，共一百一十四页。,花药培养单倍体细胞(xbo)和胚状体,细胞(xbo)和集合体悬浮培养,球形,形成(xngchng)胚状体,心形期,鱼雷期,子叶期,外植体,外植体在培养中直接振荡,在培养液中振荡,在生长素-营养物琼脂培养基上生长的愈伤组织,植物组织培养的一般过程的完整周期图解,第十三页，共一百一十四页。,（1）培养材料(cilio)的采集,组织培养所用的材料非常广泛，可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶，有时也利用花粉粒和花药，其中根尖不易灭菌，一般很少采用。对于木本花卉来说，阔叶树可在一、二年生的枝条上采集，针叶树种多采种子内的子叶或胚轴。草本植物多采集茎尖。在快速繁殖中，最常用的培养材料是茎尖，通常切块在0.5厘米左右，如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度(chngd)在0.1毫米以下。,第十四页，共一百一十四页。,（2）培养(piyng)材料的消毒,先将材料用流水冲洗干净，最后(zuhu)一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。在无菌坏境中将材料放入70酒精中浸泡3060秒。再将材料移入漂白粉的饱和液或0.01升汞水中消毒10分钟。取出后用无菌水冲洗三、四次。,第十五页，共一百一十四页。,（3）制备(zhbi)外植体,将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片(ypin)则不需剥皮。然后切成0.20.5厘米厚的小片，这就是外植体。在操作中严禁用手触动材料。,第十六页，共一百一十四页。,（4)接种(jizhng)和培养,接种：在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种410个。封口：接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。温度：培养基大多应保持在25左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。增殖：外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了(wi le)扩大繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖1个月左右后，可视情况进行再增殖。根的诱导：继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。1个月后即可获得健壮根系。,第十七页，共一百一十四页。,（5）组培苗的练苗和移栽(y zi),试管苗从无菌以及光照、温度、湿度稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放3天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分(shufn)管理，保持较高的空气湿度（相对湿度98左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。,第十八页，共一百一十四页。,这是哪个(n ge)阶段？,这是哪个(n ge)阶段？,植物(zhw)组织培养流程图,第十九页，共一百一十四页。,3.3.5 植物组织器官(qgun)培养,1.定义 植物组织器官培养就是在植物细胞全能性理论指导下，在组织以及器官水平上开展研究的，其目的(md)是实现植物细胞的全能性以完成植物生命周期的过程。,第二十页，共一百一十四页。,2.愈伤组织(zzh)诱导,（1)愈伤组织形成特点 由外植体或单个细胞(xbo)形成愈伤组织一般要经过3个步骤：启动期（或诱导期）分裂期 分化期,第二十一页，共一百一十四页。,启动期（或诱导期）:是成熟组织在各种刺激因素的诱导作用(zuyng)下细胞内蛋白质及核酸的合成代谢迅速加强的过程。受激作用(zuyng)后分裂前细胞的主要变化有：一是呼吸作用加强，消耗氧量明显增加；二是多聚核糖体的不断增加，到有丝分裂前RNA的含量可增加300%；三是蛋白质合成加快，分裂前细胞内蛋白质的总量增加200%；四是各种与分裂有关的酶活性大大加强。,第二十二页，共一百一十四页。,分裂(fnli)期：其主要特征是：细胞数目增加很大，结构疏松，缺少有组织特征的结构，一般呈现透明状或浅颜色。,分化期：停止分裂的细胞发生生理代谢方面的变化，出现(chxin)了形态和生理功能上的分化，直至出现(chxin)了分生组织的瘤状结构及维管组织。此时，细胞体积不再减小，呈现的颜色多种多样。,第二十三页，共一百一十四页。,（2）愈伤组织(zzh)的生长及分化,第二十四页，共一百一十四页。,（3）影响(yngxing)愈伤组织培养的主要因素,外植体:虽然所有植物都有被诱导产生愈伤组织的潜在能力，但是不同的植物种类诱导形成愈伤组织的难易程度差别很大。基本培养基：众多的培养基基本上都可以诱导出愈伤组织，但不同的植物种类、基因型和外植体诱导形成愈伤组织的难易程度不同，对培养基的反应(fnyng)也有差别。激素组合：通常高浓度的生长素和低浓度的激动素有利于愈伤组织的诱导和增殖。其中，2,4-D是诱导愈伤组织最有效的物质。,第二十五页，共一百一十四页。,3.举例(j l),以番杏的组织培养为例介绍组织器官培养技术：番杏别名洋菠菜，属番杏科番杏属的多年生草本植物。主要以肥厚多汁的嫩茎叶作蔬菜食用，并可全株入药，有凉血、解毒、利尿、消疮疥等的功效。具体方法如下：（1）材料和培养基：番杏果实和幼苗；(1）芽分化培养基：MS+6-BA1.0mg/L（单位下同）+NAA0.1+3.0%蔗糖;(2）诱导愈伤组织与分化培养基：MS+6-BA 1.0+2,4-D 0.5+3.0%蔗糖;(3）生根培养基：3/4MS+NAA0.1+1.5%蔗糖;(4）继代(j di)培养基：MS培养基。以上各培养基加0.7%琼脂，PH5.8。（2）培养条件：培养温度25左右，日光灯照明，每天光照10h,光照强度10001500lx。,第二十六页，共一百一十四页。,（3）无菌苗的获取：将番杏果实在浓硫酸中浸泡约1h，流水冲洗30min。再在超净工作台（图示）内用70%乙醇浸泡2-3min，在无菌滤纸上吸干或酒精灯焰烧干，再用0.1%升汞浸泡10min,无菌水冲洗3-4次,用无菌手术刀轻轻刮去果实被腐蚀的部分(b fen)，然后将其接种于培养基（3）中，培养1周后种子长出无菌苗（图示）。（4）愈伤组织培养：切取0.5cm长的不带腋芽的茎段，置于（2）号培养基上。3周后，茎段周围出现白色松脆的愈伤组织（图示）。愈伤组织的形成标志着接种外植体的生长状态已脱离分化状态，开始重新恢复分生能力。,第二十七页，共一百一十四页。,超净工作台,番杏无菌苗(jn mio),番杏愈伤组织(zzh),第二十八页，共一百一十四页。,（5）继代培养：将愈伤组织在无菌条件下从试管中取出，用无菌水洗净，以镊子和解剖刀剔除附着在愈伤块上的培养基，并用无菌水反复冲洗数次，直至愈伤块上无残留培养基为止。用解剖刀将愈伤块切成数小块，在接种到装有愈伤组织诱导培养基的三角瓶中，再与诱导愈伤组织相同的培养条件下继续培养。几天后，三角瓶