2022年医学专题—细胞培养常用技术(1).ppt

细胞培养常用(chn yn)技术,第一页，共一百一十七页。,Cell,第一类研究方法,形态观察(gunch)技术,第二类研究方法,生物化学分析(huxu fnx)技术,第三类研究(ynji)方法,细胞生理学技术,第四类研究方法,其它实验技术,第二页，共一百一十七页。,第一节 细胞形态结构(jigu)观察技术,1.普通(ptng)光镜的结构:,（一）普通(ptng)光学显微镜,一、光学显微镜,第三页，共一百一十七页。,第四页，共一百一十七页。,2.普通(ptng)光镜的成像原理,光学显微镜的光路图,第五页，共一百一十七页。,分辨率,分辨率指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力，通常是用相邻两点间的距离来表示.与数值孔径的关系：D=0.61/NA=0.61/Nsin(/2)D为分辨率;为光波波长;要提高分辨率，可采取使用短波长光源、采用介质(jizh)折射率高的袖浸系、增大孔径角以提高NA值等措施。,第六页，共一百一十七页。,倒置显微镜,第七页，共一百一十七页。,生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生(chnshng)圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。,显微镜观察(gunch),细胞(xbo)的生长状态,第八页，共一百一十七页。,BMSCs,第九页，共一百一十七页。,培养细胞的生长(shngzhng)过程,第十页，共一百一十七页。,Anip973,第十一页，共一百一十七页。,在普通光学显微镜下，细胞结构呈半透明状，不易(b y)看清。,往往将标本切片进行(jnxng)染色提高可辨程度。,第十二页，共一百一十七页。,未染色(rns),已染色(rns),第十三页，共一百一十七页。,(二)暗视野显微镜,这种显微镜使照明光线不能直接(zhji)进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。,中央(zhngyng)遮光板,第十四页，共一百一十七页。,视野的背景(bijng)黑物体的边缘亮,第十五页，共一百一十七页。,利用这种显微镜能见到小至5nm的质点，分辨率比普通(ptng)显微镜高了40倍，有一些细胞器，如核、线粒体，均清晰可见。,第十六页，共一百一十七页。,(三)相差(xin ch)显微镜,由荷兰物理学家F.Zernike(1932)发明：提高了活细胞结构的反差，从而解决了对活细胞观察(gunch)的难题。,获诺贝尔物理奖(1953),(phase contrast microscope),光通过不同密度物质时滞留的时间不同，利用相差板，将厚度(hud)的差别转化成明暗的差别，增加反差。,第十七页，共一百一十七页。,特点：在聚光器或光源上加了一环形(hun xn)光阑(annular diaphragm),在物镜中加了一环形相板(annular phase plate)。,相差(xin ch)显微镜的构造:,上有一环形区，制成凹槽或凸起（亦可涂上特殊物质）：环形区的设计深度（或高度）恰好(qiho)可使通过此区的光线提前或延后1/4光程差。,使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。,第十八页，共一百一十七页。,相差(xin ch)显微镜的构造,第十九页，共一百一十七页。,相差(xin ch)显微镜的光路图解,根据设计，只有未透过标本的直射光可通过相板环形区，而透过标本的偏折光则由相板其他部分通过。两组光线和轴后发生(fshng)干涉现象。,第二十页，共一百一十七页。,两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差(fnch)（正反差）结构比周围介质更加变暗。,未透过(tu u)标本的直射光（通过相板环形区）与透过标本的偏折光（由相板其他部分通过）和轴后发生干涉：,S-D,S,D,如果(rgu)为凹形相板：,通过样品的光线延后1/4,-1/4,-1/4,第二十一页，共一百一十七页。,则两组光波相加，振幅加大，形成亮反差（负反差）标本(biobn)结构比周围介质更加变亮。,S+D,S,D,如果(rgu)为凸性相板：,由于标本的各种结构的厚度和折射系数(xsh)不同，在相差显微镜下显示出不同的明暗度。,-1/4,+1/4,第二十二页，共一百一十七页。,显微镜观察(gunch),相差显微镜（phase contrast microscope）活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，所以用普通光镜无法看清未经染色的活细胞。20世纪30年代 荷兰 Zernike 原理：利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构(jigu)之间呈现清晰可见的明暗对比，从而使标本的各种结构(jigu)变得清晰。,第二十三页，共一百一十七页。,相差显微镜观察(gunch)活细胞的步骤如下：,调整(tiozhng)好相差显微镜,观察(gunch)瓶皿准备,调光,调焦与摄影,细胞观察,第二十四页，共一百一十七页。,第二十五页，共一百一十七页。,(四)微分(wi fn)干涉差显微镜,Nomarski(1952)在相差(xin ch)显微镜原理的基础上发明的：又称Nomarski相差显微镜，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。,(differential interference contrast(DIC)microscope),与相差显微镜相比，其标本(biobn)可略厚一点，折射率差别更大。,第二十六页，共一百一十七页。,DIC显微镜首先DIC利用的是偏振光。此外，除了物镜外，还增加(zngji)了四个光学组件：偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。,DIC显微镜使细胞的细微结构立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植等生物工程(shn w n chn)的显微操作常在这种显微镜下进行。,第二十七页，共一百一十七页。,第二十八页，共一百一十七页。,荧光(ynggung)显微镜的成象原理,(五)荧光(ynggung)显微镜,第二十九页，共一百一十七页。,分裂细胞的免疫荧光图像(t xin),不同(b tn)荧光染料,标记(bioj),抗 体,特异性结合,免疫荧光技术,抗原(细胞的蛋白质成分),第三十页，共一百一十七页。,用荧光素标记抗体所显示出的细胞中蛋白质的分布(fnb)状态,第三十一页，共一百一十七页。,(六)激光(jgung)共聚焦显微镜,(Laser Confocal Microscope,LCM),光源(gungyun)：,通过共聚焦可进行光学切片对固相、液相物体(wt)均可进行观察,特点：,激光,Q550MW型LCM,第三十二页，共一百一十七页。,二.主要电镜制作(zhzu)技术,三.扫描(somio)隧道显微镜,一.电镜基本知识,二、电子显微镜,电镜问世(wnsh)的必然性,第三十三页，共一百一十七页。,光学(gungxu)显微镜 0.2m电子显微镜 0.2 n m,透射(tu sh)电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）,第三十四页，共一百一十七页。,电子显微镜与光镜的主要(zhyo)区别,第三十五页，共一百一十七页。,0.61 D=NSin/2,：波长(bchng),N：介质(jizh)折射率,：物镜镜口角（标本(biobn)在光轴的一点对物镜镜口的张角）,通常最大值可达140，空气中N=1，最短的可见光波长=450nm，因此，普通光镜的最大分辨率是0.2m。肉眼的分辨率为0.2mm，因此，光学显微镜的最大的放大倍数为1000。,分辨力(resolution)是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力，通常是用相邻两点间的距离来表示，可通过公式换算出：,一、电镜基本知识：,第三十六页，共一百一十七页。,各种(zhn)光及电子束的波长,第三十七页，共一百一十七页。,Ruska(19331938)便选择了电子束为光源来突破光学(gungxu)显微镜分辨率的极限，发明了透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)。,电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，其波长与发射(fsh)电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。,第三十八页，共一百一十七页。,透射(tu sh)式电子显微镜(TEM),第三十九页，共一百一十七页。,中幼红细胞透射电镜,血小板纵切面透射电镜,第四十页，共一百一十七页。,由于(yuy)电子束不能透过玻璃，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有0.05m的超薄切片，并放在铜网上。这种切片需要用超薄切片机制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍。,1.超薄切片(qi pin)技术,二、主要电镜制作(zhzu)技术：,第四十一页，共一百一十七页。,以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度2050nm，切片采用重金属盐染色，以增大(zn d)黑白反差。,第四十二页，共一百一十七页。,用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸出处则没有染料沉积，从而出现负染效果(xiogu)，分辨力可达1.5nm左右。,示肌动蛋白纤维,2.负染色(rns)技术,第四十三页，共一百一十七页。,亦称冰冻断裂(freeze-fracture)，是研究生物膜内部结构的一种有用的技术，关于膜结构的许多资料(zlio)即是利用这种方法取得的。,冰冻(bngdng)断裂技术也是研究细胞内部各种细胞器结构的有用手段。,(freeze-etching),3.冰冻蚀刻技术(jsh),第四十四页，共一百一十七页。,将标本于-100干冰中或-196液氮中，超低温冰冻。然后用冷刀骤然(zhurn)将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面结构蚀刻(etching)。,冰冻蚀刻技术(jsh)的操作步骤:,第四十五页，共一百一十七页。,蚀刻后，再向断裂上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后(rnhu)将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下，此膜即为复膜(replica)。,复膜,复膜显示(xinsh)出了标本蚀刻面的形态，可置于透射电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。,第四十六页，共一百一十七页。,细胞冰冻(bngdng)断裂后的电镜图像,第四十七页，共一百一十七页。,电子枪发射出的电子束作为“探针”，在样品表面进行扫描，电子束激发样品表面放出次级电子，次级电子的多少(dusho)与样品表面的结构有关，被电荷的栅极收集后，即向电子显象管发送信号，在荧光屏上相应位置显示出明、暗差别。图像为立体形象，反映了标本表面的真实结构。,用来观察标本的表面(biomin)形态结构。,(scanning electron microscope,SEM),4.扫描电镜技术(jsh),第四十八页，共一百一十七页。,当探针沿物质表面扫描时，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图象化，即可显示(xinsh)出原子水平的凹凸形形态。,第四十九页，共一百一十七页。,扫描式电子显微镜,第五十页，共一百一十七页。,扫描式电子显微镜,第五十一页，共一百一十七页。,耳听毛的扫描电镜图像(t xin),第五十二页，共一百一十七页。,第五十三页，共一百一十七页。,第五十四页，共一百一十七页。,其关键部件是有一个加上一定(ydng)电压的精密探针，当探针接近物质时，由于隧道效应而有电子飞出，从而在探针与物质之间有电流通过。,1981年，Binnig、Rohrer等发明(fmng)：,荣获(rn hu)1986年诺贝尔奖！,据量子力学中隧道效应设计，用来显示晶体表面原子布阵,(scanning tunneling microscope,STM),