2022年医学专题—细胞破碎蛋白质复性和固液分离(1).ppt

第二篇 目标产品的分离(fnl)与纯化,第五章 细胞破碎(p su)、蛋白质复性和固液分离,第一页，共九十五页。,细胞(xbo)破碎,固液分离(fnl),初级(chj)分离(粗),纯化精制,下游技术基本过程,第二页，共九十五页。,下游加工技术的重要性 1.产品分离纯化是最终获得商业(shngy)产品的环节。2.投资费用高（抗生素、乙醇、柠檬酸占60%）。3.分离纯化技术落后会阻碍发酵工程技术的发展。,第三页，共九十五页。,几种产品(chnpn)在发酵液中的浓度 产品 典型浓度（g/L）抗生素 25 氨基酸 100 酒精 100 有机酸 100 酶 20 蛋白质 10,第四页，共九十五页。,下游加工技术的特点 1.发酵液的复杂性造成分离上的困难性。2.欲提取的产物通常浓度低且很不稳定(wndng)。3.多为分批操作，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定弹性。,第五页，共九十五页。,产物提纯过程的不同决定于：对象材料(cilio)、目标产物特性及对其纯度的要求,第一节 概述(i sh),第六页，共九十五页。,基因工程生物制品(shn w zh pn)分离纯化:,工程菌经过(jnggu)大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高,分离(fnl)纯化极其重要,基因工程药物从转化细胞、生产，对产品的纯度要求高于传统产品。,第七页，共九十五页。,基因工程制品分离(fnl)纯化的一般流程,第八页，共九十五页。,初级分离：分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物，溶解(rngji)包含体（包涵体），复原蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂质等过程。主要决定产物的得率。纯化精制：初级分离基础上，用各种高选择性手段，主要是各种层析技术，将目标产物和干扰杂质尽可能分开，使产物的纯度达到有关要求。主要决定产物的纯度。,产物(chnw)提纯过程包括两个基本阶段：,第九页，共九十五页。,第二节 细胞(xbo)破碎,目的：释放细胞内含物。分类：按照是否存在(cnzi)外加作用力分为机械法和非机械法。,问题(wnt)：破碎率是否越高越好？,以大肠杆菌为宿主药物多为胞内产物,第十页，共九十五页。,细胞(xbo)破碎方法分类图,第十一页，共九十五页。,1、高压(goy)匀浆法,组成：高压泵和匀浆阀作用机理：高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方向从出口管喷出，使细胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大(jio d)的变形，从而达到破碎细胞的目的。,第十二页，共九十五页。,高压(goy)匀浆阀结构示意图,进液口,出液口,阀座,碰撞(pn zhun)环,阀杆,高压(goy)匀浆器,第十三页，共九十五页。,19.6-25.4MPa,适用于酵母和大多数细菌(xjn)细胞的破碎,第十四页，共九十五页。,高压匀浆(yn jin)法动力学方程,破碎效率与匀浆阀结构、操作压力和破碎次数有关(yugun)：Ln(Rm/(Rm-R)=KNPaR：单位生物量释放出的产物量（mg/G)Rm：R的最大值；K：破碎速率常数；N：破碎次数；P：操作压力；a:与微生物性质有关的指数系数。,第十五页，共九十五页。,破碎率-操作压力-温度控制-能耗温度对活性物质的失活作用提高压力需增加(zngji)能耗：3.5KW/100MPa移走热量需付出代价：23.8/100MPa,高压(goy)匀浆一般需多级操作，每次循环前往往进行级间冷却,匀浆(yn jin)过程中产生的热蛋白质和酶的失活,温控和能耗,第十六页，共九十五页。,堵塞（不适合团块状或丝状真菌），质地坚硬(jinyng)者如包含体易损伤匀浆阀，也不适用温度高易失活，能耗大。,存在(cnzi)的问题,第十七页，共九十五页。,2、高速(o s)珠磨法,原理：细胞和极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间及珠子与细胞之间互相(h xing)剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放内含物。,第十八页，共九十五页。,几种(j zhn)常见珠磨器,第十九页，共九十五页。,动力学方程(fngchng),间歇操作:Ln(Rm/(Rm-R)=Ln(D)=Kt 其中，D=(1+K1/j)j连续操作：Ln(Rm/(Rm-R)=KV/f=K上式中，t是破碎时间；K、K1、K是破碎速度常数；V是破碎室内悬浮液的体积；f是进料速度；是平均(pngjn)停留时间；j是破碎时全混釜的数目，反映破碎室内悬浮液的流动状况。,第二十页，共九十五页。,采用夹套冷却的方式实现温控,效果(xiogu)较好;能耗与细胞破碎率成正比;,问题：高压(goy)匀浆比珠磨法破碎细胞的效果好？,温控和能耗(nn ho),第二十一页，共九十五页。,高压匀浆(yn jin)法与高速珠磨法的比较,第二十二页，共九十五页。,X-Press挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却至-25-30，形成冰晶，用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀孔中挤出，冰晶体磨损(m sn)和包埋在冰中的细胞变形引起细胞破碎。其优点是细胞碎片粉碎程度低，生物活性保持较好。,第二十三页，共九十五页。,3、超声破碎(p su),机理：声频高于1520kHz的超声波在高强度声能输入时可以进行(jnxng)细胞破碎，破碎机理尚未清楚，可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。破碎效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。优点：操作简便，液量损失少存在问题：使敏感物质变性失活，噪声大，大容量时效率低，应用潜力有限。,第二十四页，共九十五页。,空化现象：在强声波作用下，引起气泡形成(xngchng)，胀大和破碎的现象。,锡箔纸测试空化强度(qingd)与空化密度,看得到(d do)的空化现象,第二十五页，共九十五页。,超声波破碎(p su)仪,大功率超声波破碎(p su)仪,第二十六页，共九十五页。,4、化学(huxu)渗透法,作用机理：某些有机溶剂，抗生素，表面活性剂，金属螯合剂，变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内容物有选择地渗透出来，这种处理方法叫渗透法。问题：EDTA、甲苯(ji bn)、Triton X-100、盐酸胍和脲的作用机理？,P70,第二十七页，共九十五页。,EDTA：破坏细胞的外层膜甲苯：溶解细胞膜的磷脂(ln zh)层Triton X-100：溶解内膜的双磷脂层盐酸胍和脲：削弱溶质分子间的疏水作用，使疏水性化合物溶于水溶液,第二十八页，共九十五页。,优点（相对机械破碎）：对产物释出有一定的选择性；细胞保持完整(wnzhng)，碎片少，利于进一步提取；核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。缺陷：时间长，效率低；化学试剂有毒；通用性差,第二十九页，共九十五页。,5、酶溶法,机理：利用(lyng)生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解。常用的溶酶：溶菌酶(lysozyme)、-1,3-葡聚糖酶(glucanase)、-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶（protease)、甘露糖酶(mannanase)、肽链内切酶（endopeptidase)、壳多糖酶(chitinase)、细胞壁溶解酶（几种酶的复合物）等。,第三十页，共九十五页。,优点：一定的选择性；细胞(xbo)外形完整，核酸释放少，有利于进一步分离过程 缺点：（只能用于实验室）产物抑制造成效率低下；溶酶价格高；通用性差，不易确定最佳条件；,第三十一页，共九十五页。,6、微波(wib)加热法,机理：微波加热导致细胞内极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生(chnshng)大量热量，使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生(chnshng)的压力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成微小孔洞，进一步加热可导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。,第三十二页，共九十五页。,优点：微波穿透性强，选择性高、加热效率高。缺陷：一般只适合(shh)对热稳定物质的分离；被处理的物料要具有良好的吸水性；不适于富含淀粉和树胶等的天然植物,第三十三页，共九十五页。,机械(jxi)破碎法与非机械(jxi)破碎法的比较,第三十四页，共九十五页。,克隆(k ln)表达的产物,基因工程(jyn gngchng)细胞,蛋白质,没有活性，一级结构正确，立体构型错误(cuw)，无生物学活性！包涵体,第三节 蛋白质复性,难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。,第三十五页，共九十五页。,病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成(xngchng)一种蛋白质性质的病变结构包涵体,SEM of E.coli containing inclusion bodies,SEM of isolated washed inclusion bodies,第三十六页，共九十五页。,包含体形成原因：（比较复杂，目前尚不完全清楚。）缺少某些协助因子（分子伴侣？）或者由于周围物理环境（温度等）不适，使其难以(nny)连续进行次级键的形成，中间产物相互凝集而积累形成包含体。应该考虑的事：设法减少包含体的形成！,第三十七页，共九十五页。,减少(jinsho)包涵体形成的策略1、降低重组菌的生长温度 降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。,第三十八页，共九十五页。,培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长(shngzhng)、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长(shngzhng)添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl。,3、供给(gngj)丰富的培养基，创造最佳培养条件如供氧、pH等。,2、添加可促进重组蛋白质可溶性表达(biod)的生长添加剂,第三十九页，共九十五页。,蛋白质的复性(f xn)：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。,如何(rh)使包涵体的构型复原成正确状态？,第四十页，共九十五页。,包含(bohn)体的分离及溶解,分离包含体：对培养收集的细胞进行破碎(高压匀浆结合溶菌酶处理)，然后离心(500020000g/r)，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。洗涤：除去包涵体沉淀的脂类和膜蛋白，一般加去污剂（Triton X-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）。以避免包涵体溶解和复性的过程(guchng)中重组蛋白质的降解。,第四十一页，共九十五页。,溶解：包涵体的溶解必须用很强的变性剂，通过离子(lz)间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。以异氰盐酸胍的增溶效果最强，尿素稍差；去污剂（如SDS）可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸（如70%甲酸）可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。,第四十二页，共九十五页。,对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂（如DTT、GSH、-ME）打开(d ki)蛋白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解。同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。,第四十三页，共九十五页。,蛋白质的折叠(zhdi)机理,目前有多种不同的假设，但很多学者(xuzh)认为有一个“熔球态”的中间状态，在“熔球态”中，蛋白质的二级结构已经基本形成，其空间结构也初具规模，再做一些局部调整就可形成正确的立体结构。,第四十四页，共九十五页。,蛋白质的具体步骤可用下式描述：伸展(shnzhn)态中间体后期中间体天然态体聚集体,第四十五页，共九十五页。,核糖核酸(h tn h sun)酶的变性和复性示意图(A)天然核糖核酸酶(B)变性失