2022年医学专题—磁性纳米材料的细胞氧化应激检测(1).ppt

1,一、制备磁性(cxng)Fe3O4纳米颗粒的意义：,纳米材料是指具有纳米量级的超微粒构成(guchng)的固体物质。纳米材料在化学、冶金、电子、航天、生物和医学等领域展现出广阔的应用前景。运用于生物医学领域的纳米材料被称之为纳米生物材料。其中磁性纳米生物材料具有小尺寸效应、良好的磁导向性、生物相容性、生物降解性和活性功能基团等特点，可结合各种功能分子，如酶、抗体、细胞、DNA或RNA等，并利用其磁性进行定位、分离和分类，在靶向药物、酶的固定化、免疫测定、细胞的分离与分类等方面有着广泛的研究。,第一页，共十四页。,2,小尺寸(ch cun)效应：,小尺寸效应(Small size effect)，当颗粒的尺寸与光波(gungb)波长、德布罗意波长以及超导态的相干长度或透射深度等物理特征尺寸相当或更小时，晶体周期性的边界条件将被破坏，非晶态纳米粒子的颗粒表面层附近的原子密度减少，导致声、光、电、磁、热、力学等特性呈现新的物理性质的变化称为小尺寸效应。对超微颗粒而言，尺寸变小，同时其比表面积亦显著增加，从而产生如下一系列新奇的性质。,小尺寸(ch cun)效应,特殊的光学性质,特殊的热学性质,特殊的磁学性质,特殊的力学性质,第二页，共十四页。,3,磁导向性：,人们发现鸽子、海豚、蝴蝶、蜜蜂以及(yj)生活在水中的趋磁细菌等生物体中存在超微的磁性颗粒，使这类生物在地磁场导航下能辨别方向，具有回归的本领。磁性超微颗粒实质上是一个生物磁罗盘，生活在水中的趋磁细菌依靠它游向营养丰富的水底。通过电子显微镜的研究表明，在趋磁细菌体内通常含有直径约为 210-2微米的磁性氧化物颗粒。小尺寸的超微颗粒磁性与大块材料显著的不同，大块的纯铁矫顽力约为 80安米，而当颗粒尺寸减小到 210-2微米以下时，其矫顽力可增加1千倍，若进一步减小其尺寸，大约小于 610-3微米时，其矫顽力反而降低到零，呈现出超顺磁性。利用磁性超微颗粒具有高矫顽力的特性，已作成高贮存密度的磁记录磁粉，大量应用于磁带、磁盘、磁卡以及磁性钥匙等。利用超顺磁性，人们已将磁性超微颗粒制成用途广泛的磁性液体。,第三页，共十四页。,4,二、实验(shyn)目的：,使学生掌握用动物细胞评价生物纳米材料生物相容性的方法技术。具体检测小鼠单核巨噬细胞对磁纳米材料的细胞氧化应激。要求学生掌握MTT测定细胞生长的方法、普鲁士蓝染色法和超薄切片透射电镜观察法分析磁性纳米颗粒进入细胞的技术，以及检测细胞氧化应激的一些主要指标(zhbio)及技术。包括（1）分光光度法测定细胞培养液中超氧化物歧化酶，丙二醛，黄嘌呤氧化酶的含量（2）细胞流式仪测定自由基产生（3）荧光酶标仪测定线粒体损伤。,第四页，共十四页。,5,三、实验(shyn)原理：,1、普鲁士蓝染色(rns)：,原理：铁离子遇到亚铁氰根会产生(chnshng)蓝色的亚铁氰化铁沉淀。,2、MTT比色法检测细胞生长：,四挫盐比色实验是一种检测细胞存活和生长的方法。实验所用的显示剂四挫盐是一种能接受氢原子的燃料，化学名3-（4,5-二甲基噻挫-2）-2,5-二苯基四氮挫溴盐，商品名是噻挫蓝，简称为MTT。活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶解的紫蓝色结晶物并沉积在活细胞中，而死细胞没有此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570nm波长测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。,第五页，共十四页。,6,3、超氧化物(cho yn hu w)歧化酶测定,SOD对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用。此酶能清楚超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，该试剂采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力。可测实验用动物的血清（浆）、脑脊液、胸水、腹水、肾透析液、尿液、精液、红细胞、白细胞、血小板、心肌培养细胞，肿瘤培养细胞，各种动植物细胞，及亚细胞水平中的SOD活力。通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生(chnshng)超氧阴离子自由基，后者氧化氢胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光光度计测其吸收度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸亚减少，比色时测定管的吸光度低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。,第六页，共十四页。,7,四、实验(shyn)材料：,1.12nm的Fe3O4处理细胞2.小鼠单核巨噬细胞3.普鲁士蓝染液A4.0.1%核固红染液配方(pi fng)5.普鲁士蓝染液B6.4%多聚甲醛配方7.0.2MPBS配方8.固定液配方9.3-（4,5-二甲基噻挫-2）-2,5-二苯基四氮噻溴盐，商品名噻挫蓝，简称MTT10.二甲基亚砜11.超氧化物歧化酶测定试剂盒12.微量丙二醛测定试剂盒,13.黄嘌呤氧化酶测定(cdng)试剂盒14.细胞内活性氧水平检测15.线粒体膜电位检测试剂盒,第七页，共十四页。,8,五、实验(shyn)步骤：,1.普鲁士蓝染色(rns),（1）RAW264.7贴壁培养一天，处于对数生长期；（2）加入不同浓度的纳米(n m)粒子，一定时间后，光镜下观察下观察纳米(n m)粒子的摄入情况。（3）PBS洗涤纳米粒子干预后的细胞（4）4%多聚甲醛固定10min（5）弃去多聚甲醛，PBS再次洗涤（6）普鲁士蓝染色（A液和B液等体积混合，静置5min后即可使用）染色20min（7）弃去普鲁士蓝染液，PBS再次洗涤（8）核固红复染10min（9）弃去核固红染液，PBS再次洗涤（10）显微镜下观察，拍照。,第八页，共十四页。,9,2.电镜检查(jinch)方法：,（1）胰酶收集纳米粒子干预好的细胞(xbo)（2）PBS清洗一遍（3）PBS和固定液等体积混合的液体清洗一遍，弃上清；（4）加入固定液，沉淀在固定液底部，过夜（5）1%锇酸再固定1h（6）丙酮梯度脱水（7）Epon-812树脂包埋（8）半薄切片定位（9）70nm超薄切片（10）醋酸铀-柠檬酸铅双重电子染色（11）JEM-1200透射电镜观察,第九页，共十四页。,10,六、实验(shyn)结果：,0-0,0-50,0-100,第十页，共十四页。,11,0-200,1-50,第十一页，共十四页。,12,1-100,1-200,第十二页，共十四页。,13,杨文清 11208120指导老师(losh)：熊非老师(losh)2011.05.10,第十三页，共十四页。,内容(nirng)总结,1。纳米材料是指具有纳米量级的超微粒构成的固体物质。磁性超微颗粒实质上是一个生物磁罗盘，生活在水中的趋磁细菌依靠它游向营养(yngyng)丰富的水底。利用超顺磁性，人们已将磁性超微颗粒制成用途广泛的磁性液体。使学生掌握用动物细胞评价生物纳米材料生物相容性的方法技术。SOD对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用。（6）普鲁士蓝染色（A液和B液等体积混合，静置5min后即可使用）染色20min。0-0。2011.05.10,第十四页，共十四页。,