2022年医学专题—土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用(1).ppt

课题2土壤中分解尿素(nio s)的细菌的分离和计数,课题2 微生物的培养(piyng)与应用,第一页，共三十八页。,一、课题(kt)背景,1、尿素(nio s)的利用,尿素是一种重要的农业氮肥(dnfi)。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,第二页，共三十八页。,3、常见(chn jin)的分解尿素的微生物,芽孢杆菌(gnjn)、小球菌、假单胞杆菌(gnjn)、克氏杆菌(gnjn)、棒状杆菌(gnjn)、梭状芽孢杆菌(gnjn)，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,4、课题(kt)目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,第三页，共三十八页。,1、实例(shl)：,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应(xingyng)的环境中去寻找。,问：如果(rgu)请你寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找？,DNA多聚酶链式反应（PCR）是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶（930C）。,.筛选菌株,第四页，共三十八页。,问：为什么Taq细菌(xjn)能从热泉中被筛选出来？,水生耐热细菌Taq：美国科学家布鲁克于1966年在美国黄石国家(guji)公园的一个热泉中发现，并分离出耐高温的TaqDNA聚合酶。,第五页，共三十八页。,原因：因为热泉温度70800C，高温(gown)淘汰了绝大多数微生物（不耐热），只有Taq细菌被筛选出来。,【研究(ynji)思路】,（一）筛选(shixun)菌株,原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。,有选择作用,第六页，共三十八页。,要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基方法：抑制(yzh)大多数微生物生长 造成有利于该菌生长的环境，结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选(shixun)原理：,第七页，共三十八页。,3、土壤中分解(fnji)尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质(wl xngzh)看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？,固体(gt)培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,选择培养基,第八页，共三十八页。,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能利用尿素作为氮源而生存。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以(suy)用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,4、该培养基如何将分解尿素(nio s)的细菌选择出来？,选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类(zhngli)的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类(zhngli)微生物生长的培养基。,第九页，共三十八页。,分离尿素(nio s)细菌,用以判断(pndun)选择性培养基是否具有选择性,对设计实验(shyn)的训练,第十页，共三十八页。,对照组牛肉(ni ru)膏蛋白胨培养基,实验组以尿素(nio s)为氮源的培养基,第十一页，共三十八页。,【统计(tngj)菌落数目】,常用方法：稀释涂布平板法、显微镜直接计数法，还可以(ky)用过滤膜法,1、稀释(xsh)涂布平板法（也叫活菌计数法）,（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。1个菌落=1个活菌,第十二页，共三十八页。,稀释(xsh)涂布平板法。,（2）操作方法：稀释涂布平板 统计(tngj)菌落数。,（3）统计原则、选 30300 个菌落的平板统计。、每个稀释度取3个平板取其平均值。（4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此(ync)统计结果一般用菌落数来表示。,第十三页，共三十八页。,没有设置重复组，因此结果(ji gu)不具说服力。,1个平板的计数结果与另2个相差(xin ch)太远，说明在操作过程中可能出现了错误。,不能简单地将3个平板的计数值(shz)用来求平均值。,在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,统计菌落数目 P22,第十四页，共三十八页。,注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往(wngwng)比活菌的实际数目低。涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。,第十五页，共三十八页。,（三）设置(shzh)对照,在做本课题的实验时，A 同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学的结果有问题。他们分析可能是A同学的培养基被杂菌污染(wrn)了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。但是，A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿了不出令人信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同学学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？,第十六页，共三十八页。,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响(yngxing)，提高实验结果的可信度。,.设置(shzh)对照：,设置对照(duzho)的方法：,空白对照：不给对照组任何处理因素。,条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的 处理因素。,自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。,相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。,A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。,一是由于土样不同；,二是由于培养基污染或操作失误。,第十七页，共三十八页。,小结：通过(tnggu)这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案(fng n)一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为(zuwi)空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,第十八页，共三十八页。,二.实验的具体操作.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。.制备培养基：制备以尿素(nio s)为唯一氮源的选择培养基。,第十九页，共三十八页。,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程(guchng)中，每一步都要在火焰旁进行,分离(fnl)不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,三样品(yngpn)的稀释,第二十页，共三十八页。,（二）土壤(trng)稀释,二、实验设计,第二十一页，共三十八页。,第二十二页，共三十八页。,.取样(qyng)涂布,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要(xyo)重新实验。,第二十三页，共三十八页。,.微生物的培养(piyng)与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养(piyng)时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同(b tn)微生物往往需要不同(b tn)培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,第二十四页，共三十八页。,微生物的培养(piyng)与观察,第二十五页，共三十八页。,三.结果分析与评价1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样(du yn)，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,第二十六页，共三十八页。,大小、形状（圆形，假根状，不规则状）表面(biomin)特征（光滑，皱缩，颗粒状，龟裂状，同心圆状）隆起形状（扩展，台状，凹面，凸面，乳头状）边缘情况（整齐，波状，裂叶状，锯齿状）表面光泽（无光泽，金属光泽，闪光）质地（油脂状，膜状，粘脆）颜色、透明度,第二十七页，共三十八页。,四、操作(cozu)提示,无菌操作(cozu),做好标记(bioj),规划时间,第二十八页，共三十八页。,五.课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高(shn o)，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,测定(cdng)饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现深紫色，并且有金属光泽，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。,第二十九页，共三十八页。,大肠杆菌(d chn n jn)呈 黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型(dinxng)特征,第三十页，共三十八页。,本课题知识(zh shi)小结:,第三十一页，共三十八页。,六、例题(lt)解析,例1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是 A在液体培养基上进行 B至少接种(jizhng)一种细菌 C接种一个细菌 D及时补充消耗的营养物质,解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些(zhxi)条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。,答案：A,第三十二页，共三十八页。,例2在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著(xinzh)最激烈的时期是A调整期 B对数期 C稳定期 D衰亡期,解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目(shm)的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。,答案(d n)：C,第三十三页，共三十八页。,1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌 C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质 2.使用选择培养基的目的是（）A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别(qbi)3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,实践(shjin)训练,A,C,D,第三十四页，共三十八页。,4.下列说法不正确的是（）A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计