2022年医学专题—细胞分离与培养技术(1).ppt

临床药理研究所,细胞(xbo)分离与培养技术,1,第一页，共一百二十八页。,现代生物(shngw)技术,基因工程(jyn gngchng)技术,细胞工程技术(jsh),酶工程技术,发酵工程技术,细胞培养,2,第二页，共一百二十八页。,细胞分离(fnl)技术,从血液、体液中分离(fnl)细胞从原代组织中分离细胞从原培养容器中分离细胞-传代培养,原代培养(piyng),3,第三页，共一百二十八页。,细胞分离技术-从血液(xuy)、体液中分离细胞,采血方法：人 静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血；小动物（大鼠、小鼠）剪尾法、眼眶采血、心脏(xnzng)穿刺法、断颈取血或股动脉放血。兔 耳静脉或动脉穿刺取血。,4,第四页，共一百二十八页。,细胞(xbo)分离技术-从血液、体液中分离细胞,血液抗凝方法：肝素(n s)法：按每ml血液约用0.1-0.2mg肝素（即5%肝素溶液2-4l）；草酸盐法：取草酸钾0.2g，草酸铵0.3g，加双蒸水10ml溶解后，取0.2ml放入5ml的试管中，使其干燥。若采用5ml以下的血液可直接注入此试管中，轻轻摇晃；枸橼酸钠法：先配制2%枸橼酸钠，取0.15-0.2ml加于1ml血液中即可抗凝；EDTA法（186.1）：每ml血液中加0.5mmol/L EDTA 2l。,5,第五页，共一百二十八页。,细胞(xbo)分离技术-从血液、体液中分离细胞,体液标本采集：在局部70%酒精消毒灭菌后，用灭菌注射器穿刺入体腔（如胸腔，腹腔(fqing)，关节腔等）抽取液体样品。,膝关节腔穿刺(chunc),胸腔穿刺,6,第六页，共一百二十八页。,细胞分离技术(jsh)-从血液、体液中分离细胞,血样中红细胞和白细胞的分离：利用细胞的相对密度(md)或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉降法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离。抗凝血，室温或37下直立静置30-60min，红细胞沉降至下层，中间乳白色薄膜层为白细胞及血小板，上层为淡黄色血浆。也可将抗凝血与3%明胶（经灭菌消毒）等量或3l量混合于离心管中，直立静置30-60min，红细胞沉于管底，上层乳白色混浊液含白细胞。,7,第七页，共一百二十八页。,细胞分离(fnl)技术-从血液、体液中分离细胞,血中单个核细胞的分离：单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度(md)在1.050-1.077之间，采用速度沉降法原理使其分离。淋巴细胞分离液,8,第八页，共一百二十八页。,细胞分离技术(jsh)-从血液、体液中分离细胞,血中单核细胞的分离：利用细胞在培养(piyng)过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离,单个核细胞(xbo)悬液,多将悬液放入12cm直径的培养皿中，于37培养箱中静置30-60min。此时单核细胞贴壁，而淋巴细胞尚未贴壁，倾出未贴壁细胞，并用Hanks液轻轻冲洗培养皿以尽量洗下未贴壁细胞（淋巴细胞）。,用Hanks液强力冲洗吹打与震荡，将贴壁的单核细胞冲落或用刮刀轻刮，收集贴壁的单核细胞。,计数后分别制备所需浓度的细胞悬液。,9,第九页，共一百二十八页。,细胞分离(fnl)技术-从血液、体液中分离细胞,黏附(ninf)法分离血中单核细胞、T，B淋巴细胞,因B淋巴细胞和单核细胞能黏附(ninf)于尼龙纤维柱上（聚酰胺纤维柱），所以可将其与T淋巴细胞分离。,10,第十页，共一百二十八页。,具体步骤：单个核细胞用含20%小牛血清RPMI-1640制成（2.5-3）107/ml的细胞悬液。先用Hanks液，再用含20%小牛血清的RPMI-1640液冲洗(chngx)平衡尼龙纤维柱，冲洗(chngx)液尽量流净。将尼龙柱预温37，再用配制的单个核细胞悬液2ml装入尼龙纤维柱，不使流出，37温箱内静置l小时。取下注射针头，用预温37含20%小牛血清的RPM I-1640培养液冲洗尼龙纤维柱，洗出者即为未黏附的T淋巴细胞。从注射器内取出尼龙纤维，在4的RPMI-1640液内漂洗，并轻轻挤压，将黏附的B细胞洗脱收集（B淋巴细胞中混有的单核细胞可用贴壁法将其分离）。收集的T、B淋巴细胞可分别用Hanks液悬浮，洗涤，离心（250g，7min），并重复洗涤3次。计算活细胞，计数悬液中的细胞数后制备所需浓度的T和B淋巴细胞悬液。,11,第十一页，共一百二十八页。,细胞分离技术-从血液(xuy)、体液中分离细胞,免疫磁珠法(MACS)分离T、B淋巴细胞：磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加(wiji)磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。,12,第十二页，共一百二十八页。,细胞分离技术(jsh)-从血液、体液中分离细胞,免疫磁性微珠用于细胞的分离和纯化的基本原理及步骤是：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合(jih)的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离。,13,第十三页，共一百二十八页。,细胞分离技术-从血液(xuy)、体液中分离细胞,免疫磁珠分离(fnl)细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离(fnl)，如T(CD3)、B(CD19)淋巴细胞、内皮细胞(CD34)、造血祖细胞(CD34)、单核/巨噬细胞(CD14)、胰岛细胞(胰岛GK和GLUT2（葡萄糖转运子）)、多种肿瘤细胞等。,14,第十四页，共一百二十八页。,细胞分离技术-从血液(xuy)、体液中分离细胞,15,第十五页，共一百二十八页。,细胞分离技术-从血液(xuy)、体液中分离细胞,16,第十六页，共一百二十八页。,细胞分离(fnl)技术-从血液、体液中分离细胞,17,第十七页，共一百二十八页。,细胞(xbo)分离技术-从血液、体液中分离细胞,MACS技术优点：稳定、高质量的分选：纯度（90-99%）对细胞无损伤操作简便、快速(kui s)：消毒方便，手动分选30分钟内完成，autoMACS分选2.5-10分钟之内完成。从实验室到临床：MACS技术可以实现105-1011个细胞分选。有autoMACS和CliniMACS。分选后细胞适用于后续实验：分选后适用于细胞培养和体内实验，分选得到的标记和未标记细胞组分均可回收利用。从细胞到分子分选：不仅可以分选各种细胞，还可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、DNA、RNA及mRNA。,MACS技术缺点(qudin)：分离效率较流式细胞仪分选略低且耗材相对较贵，适合无大型流式细胞仪设备且对分选细胞纯度要求不高的分选。只适用于简单标记的细胞分离,18,第十八页，共一百二十八页。,细胞(xbo)分离技术-从血液、体液中分离细胞,流式细胞术分离法分离T、B淋巴细胞：密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成1107/ml；加适量FITC-抗CD3或FITC-抗CD19，4孵育30min,用RPMI-1640培养基洗2次；用流式细胞仪进行分析(fnx)。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。,19,第十九页，共一百二十八页。,细胞分离(fnl)技术-从血液、体液中分离细胞,注意事项：分选细胞常用于细胞亚群进一步的功能研究，因此，整个过程均需要严格无菌操作，流式细胞仪进行无菌冲洗。此法分离得到(d do)的T细胞纯度可达到99%,收获率可达到90%。由于喷嘴孔很小（约70100m），分选前用3040m孔径的滤网过滤细胞悬液，以免堵塞喷嘴。,20,第二十页，共一百二十八页。,细胞分离技术-从血液(xuy)、体液中分离细胞,优缺点：流式细胞仪分选纯度较高、回收率高，分选一些具有比较复杂细胞标记的细胞时相当有用的，例如要分选出白血病人骨髓中某些 CD34+CD13-CD45dim的幼稚细胞，只需要在流式上简单地逻辑设门就可以了，而且流式可以双通道分选，也就是同一时间分选出两种细胞，流式分选成本比磁珠低。流式分选最致命的缺点就是污染，且设备(shbi)昂贵，技术复杂，需专业技术人员操作，操作费时，适合对细胞纯度和回收率要求较高的分选。,21,第二十一页，共一百二十八页。,细胞分离(fnl)技术,二、从原代组织中分离细胞组织和器官采集：人标本：可采取(ciq)无菌手术法切取少量所需的组织或器官（活检和手术）。大量的动物组织：先麻醉或处死，浸入70%酒精中，使毛皮全部浸湿，从腹中线剪开皮肤，注意不要剪开胸腔或腹腔。将皮肤向上、下撕开分离并向上、下翻开，暴露胸腹部的筋膜，用生理盐水洗净黏于筋膜上的断毛，以碘酒和70%酒精消毒后，更换一套消毒灭菌的器械，剪开胸腔或腹腔，无菌采取所需器官。动物的骨髓：可以无菌手术采取一段股骨，用灭菌注射器，将小牛血清或培养液从断端一端加压注射以从另一断端出骨髓。,22,第二十二页，共一百二十八页。,细胞(xbo)分离技术-从原代组织中分离细胞,制备细胞(xbo)悬液方法：将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短，以保持最大的活性。包括胰蛋白酶、胶原酶和中性蛋白酶等。,23,第二十三页，共一百二十八页。,细胞(xbo)分离技术-从原代组织中分离细胞,1.胰蛋白酶(y dn bi mi)(Trypsin),在去除不需要的组织后，使用无钙镁的平衡(pnghng)盐溶液清洗组织块，重复清洗2到3次。用无菌的解剖刀和剪子把组织切成1-2mm3小块。,将盛有组织碎片的容器置于冰上。加入0.25溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml 胰蛋白酶）。,24,第二十四页，共一百二十八页。,细胞分离(fnl)技术-从原代组织中分离细胞,在4孵育6到18小时(xiosh)，使胰蛋白酶尽可能渗透进去,移弃组织(zzh)碎片中的胰蛋白酶，在37孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟,在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂,通过无菌不锈钢丝网（100-200目）过滤，计数和接种细胞，进行培养,25,第二十五页，共一百二十八页。,细胞(xbo)分离技术-从原代组织中分离细胞,2.胶原酶(Collagenase),用无菌解剖刀和剪子(jin zi)把剩余组织切成1-2mm3小块，用Hanks平衡液（HBSS）清洗组织碎片几次,加入胶原酶（50200单位(dnwi)/ml，溶解在HBSS中）,在37孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率,26,第二十六页，共一百二十八页。,细胞分离技术(jsh)-从原代组织中分离细胞,通过(tnggu)离心在HBSS中清洗悬液几次,再一次在培养基中悬浮细胞，计数(j sh)和接种细胞，进行培养,通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶,27,第二十七页，共一百二十八页。,细胞分离技术(jsh)-从原代组织中分离细胞,3.中性(zhngxng)蛋白酶(Dispase),用无菌解剖刀和剪子把剩余组织(zzh)切成1-2mm3小块，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次,加入Dispase（0.62.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）,在37孵育20分钟到几个小时。,28,第二十八页，共一百二十八页。,细胞(xbo)分离技术,通过(tnggu)无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase,通过离心在平衡(pnghng)盐溶液中清洗悬液几次,再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养,29,第二